牛奶中7种氟喹诺酮类药物残留检测方法

发布时间:2017-06-02  浏览次数:2158

1、安全要求

实验操作时穿工作服、戴口罩和手套；提取和净化操作都应在通风橱中进行，避免溶剂气体吸人和皮肤接触；废弃的化学试剂收集到专用容器中集中处理。

2、急救措施

皮肤接触到有机溶剂或酸、碱溶液后用清水清洗，有机溶剂或酸、碱溶液溅入眼中用清水灌洗。

3、适用范围

该标准操作规程适用于牛奶中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、二氟沙星和沙拉沙星单个或混合物残留量的确证检测。

4、职责

进行该项检验的检验员必须按该标准操作规程进行检验，质量监督员负责监督该标准操作规程的正确执行。

5、检测原理

试料中残留的氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、二氟沙星和沙拉沙星用含1％甲酸的乙腈溶液提取，HLB固相萃取柱净后，以高效液相色谱一串联质谱法测定，外标法定量。

6、方法灵敏度

氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、二氟沙星或沙拉沙星在牛奶中的检测限均为5μg/kg，定量限均为10μg/kg。

7、注意事项

净化时上样、淋洗、洗脱的流速保持在1～2mL/min。

8、材料、仪器、试剂的准备及基本要求

除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯；水为符合GB/T 6682规定的一级水。

8.1 喹诺酮类药物对照品、试剂和药物储备液、工作液准备

8.1.1 氧氟沙星 含氧氟沙星(C18H20FN3O4)不得少于99.0％。

8.1.2 诺氟沙星 含诺氟沙星(C16H18FN3O3)不得少于99.0％。

8.1.3 盐酸环丙沙星 含盐酸环丙沙星(C17H18FN3O3·HCl)不得少于99.0％。

8.1.4 恩诺沙星 含恩诺沙星(C19H22FN3O3)不得少于99.0％。

8.1.5 甲磺酸达氟沙星 含甲磺酸达氟沙星(C19H20FN3O3·CH4O3S)不得少于99.0％。

8.1.6 盐酸二氟沙星 含盐酸二氟沙星(C21H19F2N3O3·HCl)不得少于99.0％。

8.1.7 沙拉沙星 含沙拉沙星(C20H17F2N2O3)不得少于99.0％。

8.1.8 甲酸

8.1.9 正丙醇

8.1.10 乙腈色谱纯

8.1.11 甲醇色谱纯

8.1.12 乙酸铵

8.1.13 乙酸铵溶液(50mmol/L) 取乙酸铵3.85g，加水溶解并稀释至l000ml，即得。

8.1.14 l％甲酸乙腈溶液 取甲酸1mL，加乙腈稀释至100mL，即得。

8.1.15 0.1％甲酸甲醇溶液 取甲酸100μl，加甲醇稀释至100ml，即得。

8.1.16 0.1％甲酸水溶液 取甲酸100μl，加水稀释至100ml，即得。

8.1.17 标准储备液配制(1mg/mL) 分别取氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、二氟沙星和沙拉沙星7种对照品各约25mg，精密称定，置同一25mL量瓶中，用0.03mol/L氢氧化钠溶液溶解并用甲醇稀释定容至刻度，摇匀即得。置-200C冰箱中保存，有效期为6个月。

8.1.18 标准工作液配制(1μg/mL) 准确量取混合标准储备液0.1mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀即为10μg/mL的标准工作液；从中准确量取1.0ml，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀即为1μg/mL的标准工作液。置-200C冰箱中保存，有效期为3个月。

8.2 仪器和设备

8.2.1 高效液相色谱一串联质谱仪(配电喷雾离子源)

8.2.2 天平 感量0.01g

8.2.3 分析天平 感量0.00001g

8.2.4 固相萃取装置(配真空泵)

8.2.5 样品浓缩器

8.2.6 涡旋混合器

8.2.7 振荡器

8.2.8 离心机

8.2.9 鸡心瓶 50mL

8.2.10 离心管 15mL

8.2.1l 固相萃取柱Oasis HLB小柱(60mg/3mL)，或相当者。

8.2.12 微孔滤头 0.45μm

9、检验步骤

9.1 试料的制备

9.1.1 取新鲜或解冻的供试样品，作为供试试料。

9.1.2 取新鲜或解冻的空白样品(2±0.02)g，作为空白试料(阴性对照)。

9.1.3 取新鲜或解冻的空白样品(2±0.02)g，添加1μg/mL的混合对照溶液0.1mL，作为空白添加试料(阳性对照)。

9.2 提取

9.2.1 取(2±0.02)g试料，置15mL离心管中，加1％甲酸乙腈溶液5mL，涡旋混合提取10s，5000r/min离心lOmin，转移上清液至50mL鸡心瓶。

9.2.2 再用l％甲酸乙腈溶液5mL重复提取1次，合并上清液。

9.2.3 加正丙醇5mL，于500C下旋转蒸发至干。

9.2.4 残余物用50mmol/L的乙酸铵溶液4mL溶解，备用。

9.3净化

9.3.1 固相萃取柱依次用甲醇、50mmol/L乙酸铵溶液各3mL预洗活化。

9.3.2 取全部备用液过柱，用10％甲醇水溶液3mL淋洗，减压抽干。

9.3.3 用甲醇3mL洗脱，收集洗脱液，减压抽干。洗脱液于500C下氮气吹干，用初始比例流动相1.OmL溶解，涡旋混匀，过滤膜后，供高效液相色谱一串联质谱仪测定。

9.4 测定

9.4.1 色谱条件 。

9.4.1.1 色谱柱：XBridge C18150mm×2.1mm(i.d.)，粒径5μm，或相当者。

9.4.1.2 柱温：300C。

9.4.1.3 进样量：10μL。

9.4.1.4 流动相A：0.1％甲酸甲醇溶液。

流动相B：0.1％甲酸水溶液。

流动相梯度洗脱条件见表1。

9.4.2 质谱条件

9.4.2.1 离子源参考参数见表2。

9.4.2.2 质量分析器参考参数见表3。

9.4.2.3 光电倍增器电压：650V。

9.4.2.4 定性、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表4。

9.5 检测数据的质量控制

9.5.1 线性考察

准确量取适量混合标准工作液，用初始比例流动相稀释成浓度均为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL的系列混合对照溶液，量取6种浓度的混合对照溶液各1.0ml.，分别用于溶解预先按提取净化吹干后的残余物，涡旋混匀，过滤膜后作为基质匹配系列混合对照溶液，从低浓度到高浓度测定，每一浓度进样3针，以峰面积与相应对照溶液浓度绘制标准曲线，并计算回归方程及相关系数。

9.5.2 空白试验和添加试验

空白试料、基质匹配阳性添加的提取和净化采用与样品相同的方法操作。空白试料、基质匹配阳性添加试料得到的特征离子的质量色谱图分别见附录中图l和图2。

9.5.3序列表的编制

试剂空白进1针；

样品空白进2针；

对照溶液进3针，其RSD<10％；

样品1-1进1针；

样品1-2进1针；

…………

样品4-1进1针；

样品4-2进1针；

阳性添加各进1针；

对照溶液进2针；

…………

(注：顺序的任何调整应有充分理由证明其合理性)

9.5.4 定性需同时满足下列条件：

9.5.4.1 试剂空白和样品空白不能出现与阳性对照相同的离子峰。

9.5.4.2 所有离子色谱峰的信噪比(S/N)都在3:1以上，信噪比以峰对峰(PtP)计算。

9.5.4.3 试样色谱峰的保留时间，应与校正溶液的保留时间一致，容许偏差为±2.5％。

9.5.4.4 试样溶液中的离子丰度比应与校正溶液的一致，容许偏差符合表5的要求。

9.5.5 定量方法

采用基质匹配单点校准或标准曲线校准，按外标法以峰面积计算，即得。采用基质匹配标准曲线校准时试样溶液及对照溶液中7种氟喹诺酮类药物的峰面积均应在仪器检测线性范围之内。

9.6 记录与计算

9.6.1 记录项目

9.6.1.1 逐项填写中国兽医药品监察所“检验记录”首页。

9.6.1.2 对照品名称、来源、批号、含量。

9.6.1.3 储备液、工作液及对照溶液制备及制备日期。

9.6.1.4 试料制备、提取、净化、测定(包括测定过程中涉及的计量仪器编号)。

9.6.1.5 原始数据(包括仪器测定图谱和打印的数据)。

9.6.1.6 计算公式及计算过程(软件计算除外)。

9.6.2 计算

按下式计算试料中7种氟喹诺酮类药物的残留量：

式中：

X——试料中氟喹诺酮类药物的残留量(μg/kg)；

A——试样溶液中相应氟喹诺酮类药物的峰面积；

AS——基质匹配对照溶液中相应氟喹诺酮类药物的峰面积；

CS——基质匹配对照溶液中相应氟喹诺酮类药物的浓度(ng/mL)；

V——浓缩至干后，流动相溶解残余物所用体积(mL)；

m——供试试料质量(g)。

(注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字)

9.6.3 结果判定

9.6.3.1 线性范围 在lO～400ng/mL浓度范围内考察线性，计算回归方程，其相关系数R2>0.990。

9.6.3.2 准确度 本方法在50～200μg/kg添加浓度的回收率为60％～120％，。

9.6.3.3 精密度 本方法的批内变异系数≤20％，批间变异系数≤20％。

若方法学考察符合以上规定，则供试组织中药物的残留量之和 <检测限时，判定为未检出；检测限≤<最高残留限量时，判定为符合规定； ≥最高残留限量时，判定为不符合规定。

10 附加说明

10.1 本标准操作规程依据本实验室验证资料制定。

10.2 氟喹诺酮类药物最高残留限量：