骨转换相关标志物检测
发布时间：2017-09-01
反映骨形成的生化指标有总碱性磷酸酶、骨源性碱性磷酸酶、骨钙素和I型前胶原羧基端/氨基端前肽(PICP/PINP)等。
(一)骨形成标志物的检测
1．骨钙素(BGP)测定 测定BGP的方法主要为免疫标记法，如放射免疫法、双位免疫放射法、酶联免疫法、亲和素-生物素酶免疫测定法(BAEIA)、化学发光免疫分析法、免疫荧光分析法等。目前应用最多的是放射免疫法和化学发光免疫分析法。
【检测方法】
(1)放射免疫法：用碘125I标记骨钙素和未标记的骨钙素对限量的特异性抗体竞争结合反应。具体同降钙素放射免疫法原理。
(2)化学发光免疫分析法：采用双抗体夹心法原理，将标本、生物素化的抗N-MID骨钙素单克隆抗体和发光物质标记的抗N-MID骨钙素单克隆抗体混匀，形成夹心复合物。加入链霉素亲和素包被的微粒，使形成的复合物结合到微粒上。经过孵育后形成抗原一抗体复合物，经洗涤分离复合物与游离物，复合物在激发发光剂的作用下分解发光，测定复合物的发光强度，得到BGP的浓度。
【参考区间】放射免疫法：成人(4.75 4±1.33)μg/L。化学发光免疫分析法：成年男性：14.0-70μg/L；绝经前妇女：11.0-43μg/L；绝经后妇女：15.0-46μg/L。每个实验室均应制订自己的正常参考值。
【临床意义】骨钙素升高见于儿童生长期、肾性骨营养不良、畸形性骨炎、甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进、骨折、骨转移癌、低磷血症、肾功能不全等。老年性骨质疏松症可有轻度升高。高转换率的骨质疏松患者，绝经后骨质疏松BGP升高明显，雌激素治疗2～8周后BGP下降50％以上。骨钙素降低见于甲状旁腺功能减退、甲状腺功能减退、肝病、长期应用肾上腺皮质激素治疗等。
【方法评价】
放射免疫法：分析灵敏度小于1μg/L，线性范围为1～16μg/L，其不足之处在于不能鉴别所测定的降钙素是否具有生物学活性。该方法精
密度：批内CV为2.6％～4.7％，批问CV为5.7％～7.4％，回收率为(96.8土5.5)％。125I物理半衰期(t1/2)为60天。
(2)化学发光免疫分析法：受溶血干扰，血细胞含有的蛋白酶可分解骨钙素，不受黄疸(胆红素<112μmol/L)干扰。线性范围为0．50～300μg/L，分析灵敏度为0.50μg/L，本法精
密度：批内CV为1.2％～4.0％，批间CV为1.7％～6.5％。
2．骨性碱性磷酸酶(B-ALP)测定 测定B-ALP的主要设计原理是采用物理、化学或生物学方法先识别或分离出B-ALP，再测定其碱性磷酸酶的活性。热失活法、化学抑制法、电泳法、等电聚焦法、麦胚凝集素法(wheat germ agglutinin，WGA)以及高效液相色谱法(HPLC)都可用于检测B-ALP。近来建立了对B-ALP特异性很强的单克隆抗体的免疫分析法，具有高度的特异性和敏感性，而且操作简便，是目前鉴别和定量分析B-ALP的最佳方法。
【检测方法】
(1)免疫活性测定法：将抗-B-ALP包被在固相载体上，加入被检标本，抗原ALP与抗体特异性结合，洗涤其他ALP同工酶，与抗体结合的B-ALP催化对硝基酚磷酸二钠，用酶标仪405nm比色检测对硝基酚的生成量，查标准曲线得B-ALP的活性。 ．
(2)酶联免疫法：血清中的B-ALP与结合物(含有生物素标记的特异性骨性碱性磷酶单克隆抗体)结合，此结合物同时又与包被在孔壁上的链霉素亲和素反应，形成链霉素亲和素-生物素标记的特异性骨性碱性磷酸酶单克隆抗体-B-ALP复合物。经洗涤除去未能形成复合物的其他物质，再加入酶作用的底物。底物的消耗量与B-ALP的含量成正比，通过与同样处理的标准品进行比较即可求出血清中B-ALP的含量。
【参考区间】
(1)免疫活性测定法：成年男性为(24.9土7.0)U/L；成年女性为(19.7士5.6)U/L。
(2)酶联免疫法：成年男性为(1213士4．3)ug／L，绝经前妇女为(8．7士2．9)Jtg／I。，绝经后妇女为(13.2土4.7) μg/L，各实验室应建立起自己的参考区间。
【临床意义】碱性磷酸酶活性降低极少见，多数均为骨性碱性磷酸酶增高。血清碱性磷酸酶和骨性碱性磷酸酶增高见于甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进、骨转移癌、佝偻病、软骨病、骨折、畸形性骨炎、氟骨症、高骨转换型的骨质疏松患者[如绝经后的骨质疏松症(老年骨质疏松症形成缓慢，ALP变化不显著)]。发生肝胆疾病时，血清总碱性磷酸酶升高，骨性碱性磷酸酶正常。绝经期后碱性磷酸酶增高，但不超过正常值的1倍。骨性碱性磷酸酶也可用于骨转移癌患者的病程和治疗效果的监测。
【方法评价】免疫分析法具有较好的灵敏度、重复性，易于在临床实验室推广，是目前定量分析B-ALP最常用的方法。但目前免疫法存在的主要不足是抗B-ALP抗体特异性不高，与肝性ALP存在5％～20%的交叉反应。本法精
密度：批内CV为3．9％～9．5％，批间CV为4.4％～10.0％。检测灵敏度<1.0μg/L。线性范围为7～90μg/L。
3．I型前胶原羧基端前肽和I型前胶原氨基端前肽的测定 目前PINP和PICP测定方法主要采用放射免疫法、酶联免疫法和化学发光法。血清中的PINP以高分子量和低分子量两种形式存在，制备抗PNPa1，链的抗体建立的免疫标记法是测定：PINP的主要方法。
【检测方法】
(1)RIA法：目前市售的放射免疫试剂盒，均是针对PINPa1链的特异抗体，只能检测P1NP的高分子量型。基本原理同骨钙素放射免疫法测定。
(2)化学发光免疫分析法：同骨钙素测定。
【参考区间】
(1)放射免疫法：男性为38-202μg/L；女性为50-170μg/L。
(2)化学发光法：成人男性为20-40μg/L；绝经前女性为20-40μg/L；绝经后女性为20～70μg/L。
【临床意义】PINP增高见于：①儿童发育期，正常儿童血清PINP含量平均为正常成人的2倍；②妊娠最后3个月；③骨肿瘤和肿瘤的骨转移，特别是前列腺癌骨转移、乳腺癌骨转移；④其他：畸形性骨炎、酒精性肝炎、肺纤维化等。PINP降低见于绝经期后骨质疏松患者经雌激素治疗6个月后PINP可降低30％(雌激素对骨代谢的影响可通过测定PINP的浓度进行评价，但其降低的机制尚不清楚)。
【方法评价】
(1)放射免疫法：精
密度：批内CV为3.1％，批间CV为3．9％，平均回收率为106．1％，最低检测限为2μg/L。
(2)化学发光法：检测结果不受黄疸(胆红素<1112μmol/L)、溶血(血红蛋白<1.1mmol/L)、脂血(甘油三酯<17mol/L)的影响。回收率在(100±10)％之内。分析灵敏度<5μg／L，精
密度：批内CV为1.8％～2.2％，批问CV为2.3％～3.7％，检测线性范围为5～1200μg／L。
(二)骨吸收标志物测定
反映骨吸收的生化指标主要有血抗酒石酸酸性磷酸酶、尿羟脯氨酸、尿羟赖氨酸糖苷、尿中胶原吡啶交联，I型胶原羧基端/氨基末端肽等。
1、吡啶酚和脱氧吡啶酚测定 吡啶酚和脱氧吡啶酚的测定方法有纸层析法、高效液相色谱法、酶联免疫法和放射免疫法。
【检测方法】酶联免疫法：用纯化的多克隆抗体包被微孔板，制成固相载体，加入标本、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。用酶标仪在450nm波长处测定吸光度，计算样品浓度。采用测定尿中游离吡啶交联(Pyr/D-Pyr)，同时测定尿中肌酐，求两者的比值。
【参考区间】Pyr/Cr：男性13.6～25.8nmol/mmol；女性(绝经前)16.3～31.9mmol/mmol。D-Pyr/Cr：男性22.0～38.5nmol/mmol；女性3.0-7.4nmol/mmol。
【临床意义】吡啶酚水平评价已用于骨质疏松、Paget病、其他代谢性骨病、原发性甲状旁腺功能亢进和甲状腺功能亢进，以及其他伴有骨吸收增加的疾病的诊断或病情评价。绝经后妇女与绝经前比较，Pyr和D-Pyr通常比其他吸收和形成标志物增高明显，如果绝经后妇女或骨质疏松症用二磷酸盐或雌激素治疗，Pyr和D-Pyr会降低。
【方法评价】Pyr精
密度：批内CV为4.4％～7％，批问CV为4.6％～10.8％，回收率为94.8％-99.6％。D-Pvr时，精
密度：批内CV为4．4％～7％，批间CV为4．6％～10.8％，回收率为96％～106％。
2、I型胶原C端肽和N端肽测定 I型胶原C端肽和N端肽测定方法有纸层析法、高效液相色谱法、酶联免疫法和放射免疫法。
(1)CTX
【检测方法】 I型胶原C端肽(CTX)采用酶联免疫法，用纯化的CTX抗体包被微孔板，制成固相载体，向微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的CTX抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物(TMB)显色。通过标准曲线计算样品中人CTX的浓度。
【参考区间】实验室应建立自己的参考区问。
【临床意义】交联C端肽水平的评价可用于骨质疏松、Paget病、其他代谢性骨病、原发性甲状旁腺功能亢进和甲状腺功能亢进以及其他伴有骨吸收增加性疾病的诊断或病情评价。
【方法评价】精
密度：批内平均CV为4.4％，批问平均CV为5.3％。线性范围为25～800μg/L。
(2)尿液中的NTX
【检测方法】采用竞争抑制酶联免疫法(ELISA法)，用NTX包被微孔板，标本中的NTX和微孔板的NTX竞争与HRP标记的I型胶原N端肽(NTX)抗体结合，标本中的NTX的含量与微孔板上结合的抗体量成反比，微孔板经过彻底洗涤后加底物TMB显色，颜色的深浅和样品中的NTX呈负相关。可同时测定尿中肌酐，求两者的比值。
【参考区间】NTX/Cr：男性为3.0～63nmol/mmol；女性(绝经前)为5.0～65nmol/mmol；女性(绝经后)为6.0～74nmol/mmol。
【临床意义】同CTX。
【方法评价】精
密度：批内CV为5％～8％，批问CV为7％～10％。回收率平均为105%，线性范围为3.0～500nmol/mmol。
3．抗酒石酸酸性磷酸酶测定 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)测定方法有酶动力学法、电泳法、放射免疫法和酶联免疫法等。
【检测方法】
(1)酶动力学法：以L-酒石酸钠作为抑制剂，以4-硝基苯磷酸盐为底物测定酶活性。
(2)酶联免疫法：用纯化的TRAP抗体包被微孔板，制成固相载体，向微孔中依次加入标本或标准品和质控品，TRAP与孔内包被的抗TRAP单克隆抗体结合。加入底物pNPP温育，颜色的深浅和样品中的TRAP呈正相关。用酶标仪在405nm处测定吸光度，计算样品浓度。
【参考区间】
(1)酶动力学法：成人血浆3.1～5.4U/L。
(2)酶联免疫法：男性血清为22～54U/L，健康绝经前妇女为22～54U/L，健康老人为55～79U/L。
【临床意义】增高见于原发性甲状旁腺功能亢进、慢性。肾功能不全、畸形性骨炎、骨转移癌、卵巢切除术后、高转换率的骨质疏松患者。降低见于骨吸收降低的疾病，如甲状旁腺功能降低。老年性骨质疏松症患者TRAP增高不显著。
【方法评价】
(1)酶动力学法：灵敏度为0.1u/L，精
密度：批内变异CV<6.5%，批问变异CV<8％。
(2)酶联免疫法：纯化的TRAP抗体不能完全识别骨性TRAP，因此敏感性受影响。结果在参考值范围之内，不能完全排除骨代谢没有异常，因此，所有结果应该结合临床数据和其他诊断指标来解释。检测灵敏度为0.5～10U/L，精
密度：批内CV为6.0％，批问CV为9.2％，回收率为100.9%，高浓度脂血有可能降低吸光度，干扰检测结果。
4．尿HOP常用的有氯胺T化学法、离子交换色谱法和反相高效液相色谱法等。一般采用氯胺T化学法。
【检测方法】氯胺T化学法：尿中与肽结合的羟脯氨酸，经酸水解后释出。用氯胺T(N-氯-对甲基苯磺酰胺钠)将羟脯氨酸氧化，使其形成含吡咯环的氧化物。再用过氯酸破坏多余的氯胺T，终止氧化过程。同时，使氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应，生成红色化合物进行比色定量。一般检测空腹晨尿、空腹2小时尿HOP，及与Cr的比值、24小时尿：HOP等。
【参考区间】清晨第二次空腹尿，尿羟脯氨酸与肌酐的比值(HOP/Cr)的参考区间为0.06～0.016。24小时尿HOP测定的参考区间为114～300μmol/24h。
【临床意义】增加见于各种骨代谢性疾病，如Paget病、骨软化症，骨肿瘤等。严重骨折患者尿中也可增加。儿童生长期、甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进、骨转移癌、慢性肾功能不全、畸形性骨炎、高转换的骨质疏松症患者、佝偻病和软骨病，绝经后骨质疏松症等HOP升高。降低见于甲状腺功能低下、侏儒症等。老年性骨质疏松症HOP的变化不显著。
【方法评价】此法不特异，受饮食影响较大，收集24小时尿之前，应素食2～3天。
参考资料：骨代谢异常的生物化学检验
