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动物源食品中环丙氨嗪及其代谢物三聚氰胺残留检测方法――超高效液相色谱一串联质谱法
发布时间：2017-09-01
1、安全要求
实验操作时穿工作服、戴口罩和手套；提取和净化操作都应在通风橱中进行，避免溶剂气体吸入和皮肤接触；废弃的化学试剂收集到专用容器中集中处理。
2、急救措施
皮肤接触到有机溶剂或酸、碱溶液后用清水清洗，有机溶剂或酸、碱溶液溅入眼中用清水灌洗。
3、适用范围
该标准操作规程适用于鸡蛋、鸡肉和鸡肾中环丙氨嗪及其代谢物三聚氰胺残留量的确证检测。
4、职责
进行该项检验的检验员必须按该标准操作规程进行检验，质量监督员负责监督该标准操作规程的正确执行。
5、检测原理
试料中残留的环丙氨嗪及代谢物三聚氰胺用3％三氯乙酸溶液提取，MCX固相萃取柱净化后，过滤膜用超高效液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。
6、方法灵敏度
环丙氨嗪及其代谢物三聚氰胺在鸡蛋、鸡肉和鸡肾中的检测限lμg/kg，定量限为2.5μg/kg。
7、注意事项
过柱净化时上样、淋洗、洗脱的流速保持在l～2mL/min。
8、材料、仪器、试剂的准备及基本要求
除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯；水为符合GB/T 6682规定的一级水。
8.1 环丙氨嗪及三聚氰胺对照品、试剂和药物储备液、工作液准备
8.1.1 环丙氨嗪对照品 含C6H10N6不得少于98.0％
8.1.2三聚氰胺对照品 含C3H6N6不得少于98.0％
8.1.3三氯乙酸
8.1.4乙腈 色谱纯
8.1.5甲醇 色谱纯
8.1.6甲酸
8.1.7 乙酸铵
8.1.8 3％三氯乙酸溶液 称取3g三氯乙酸，用水溶解并稀释至lOOmL，混匀即得。
8.1.9 2％甲酸水溶液 量取2mL甲酸，用水稀释至100mL，混匀即得。
8.1.10 5％氨化甲醇溶液 量取5mL氨水，用甲醇稀释至lOOmL，混匀即得。
8.1.11 乙酸铵溶液(0.01mmol/L) 取乙酸铵0.8g，加水溶解并稀释至1000mL，即得。
8.1.12标准储备液(1mg/mL) 精确称取环丙氨嗪和三聚氰胺对照品各约10mg，置10mL棕色量瓶中，用50％乙腈水溶液溶解并稀释成浓度为lmg/mL的标准储备液。40C下保存，有效期为3个月。
8.1.13 1μg/mL标准工作液 精确量取lmg/mL标准储备液0.1mL，置10mL棕色量瓶中，用乙腈稀释成含环丙氨嗪和三聚氰胺1μg/mL的标准工作液；从中精密量取0.1mL，置于10mL量瓶内，用甲醇稀释至刻度，即得lOOng/mL的标准工作液。4℃下保存，有效期为3个月。
8.2仪器和设备
8.2.1 超高效液相色谱-串联质谱仪(配电喷雾离子源)
8.2.2天平 感量0.01g
8.2.3分析天平 感量0.00001g
8.2.4固相萃取装置(配真空泵)
8.2.5样品浓缩器
8.2.6涡旋混合器
8.2.7振荡器
8.2.8离心机
8.2.9鸡心瓶50mL
8.2.10离心管15mL
8.2.11固相萃取柱Oasis HLB小柱(60mg/3mL)，或相当者
8.2.12微孔滤头0.45μm
9、检验步骤
9.1试料的制备
9.1.1 取新鲜或解冻的供试样品，作为供试试料。
9.1.2取新鲜或解冻的空白样品(2±0.02)g，作为空白试料(阴性对照)。
9．1．3取新鲜或解冻的空白样品(2±0.02)g，添加lOOng/mL的混合对照溶液0.2mL，作为空白添加试料(阳性对照)。
9.2提取
9.2.1 准确称取(2±0.02)g试料，置50mL离心管内，加3％三氯乙酸溶液18mL，涡旋混合30s，超声提取10min。
9.2.2取出离心管静置10min，10000r/min离心10min，将上层溶液转移至另一离心管中，备用。
9.3净化
9.3.1 固相萃取柱依次用甲醇、水各3mL预洗活化。
9.3.2取备用液lOmL过柱，用2％甲酸水溶液、甲醇各3mL淋洗，真空抽干。
9.3.3用5％氨化甲醇溶液3mL洗脱，真空抽干，收集洗脱液。洗脱液于50℃下氮气吹干，残余物用95％乙腈水溶液1.OmL溶解，涡旋混匀，过滤膜后，供超高效液相色谱一串联质谱仪测定。
9.4测定
9.4.1 色谱条件
9.4.1.1色谱柱：BEH HILIC色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)，或相当者；
9.4.1.2柱温：30％：；
9.4.1.3进样量：10μL；
9.4.1.4流动相A：乙腈；
流动相B：0.01tool/L乙酸铵溶液；
流动相梯度洗脱条件见表1。
9.4.2 质谱条件
9.4.2.1 离子源参考参数见表2。
9.4.2.2质量分析器参考参数见表3。
9.4.2.3光电倍增器电压：650V。
9.4.2.4定性、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表4。
9.5检测数据的质量控制
9.5.1线性考察
准确量取适量标准工作液，用初始比例流动相稀释成浓度均为2.5ng/mL、5 ng/mL、10ng/mL、20ng/mL mL、50ng/mL、100ng/mL的系列混合对照溶液，量取6种浓度的混合对照溶液各1.OmL，分别用于溶解预先按提取净化吹干后的残余物，涡旋混匀，过滤膜后作为基质匹配系列混合对照溶液，从低浓度到高浓度测定，每一浓度进样3针，以峰面积与相应对照溶液浓度绘制标准曲线，并计算回归方程及相关系数。
9.5.2空白试验和添加试验空白试料、基质匹配阳性添加的提取和净化采用与样品相同的方法操作。对照溶液、基质匹配阳性添加试料得到的特征离子的质量色谱图分别见附录中图1、图2、图3和图4。
9.5.3序列表的编制
试剂空白进1针；
样品空白进2针；
对照溶液进3针，其RSD<10％；
样品1―1进l针；
样品1―2进1针；
…………
样品4一l进1针；
样品4―2进1针；
阳性添加各进1针；
对照溶液进2针；
……………
(注：顺序的任何调整应有充分理由让明其合理性)
9.5.4定性需同时满足下列条件：
9.5.4.1试剂空白和样品空白不能出现与阳性对照相同的离子峰。
9.5.4.2所有离子色谱峰的信噪比(S/N)都在3∶1以上，信噪比以峰对峰(PtP)计算。
9．5．4．3试样色谱峰的保留时间，应与校正溶液的保留时间一致，容许偏差为±2．5％。
9.5.4.4试样溶液中的离子丰度比应与校正溶液的一致，容许偏差符合表5的要求。
9.5.5定量方法
采用基质匹配单点校准或标准曲线校准，按外标法以峰面积计算，即得。采用基质匹配标准曲线校准时试样溶液及对照溶液中环丙氨嗪和三聚氰胺的峰面积均应在仪器检测线性范围之内。
9.6记录与计算
9.6.1记录项目
9.6.1.1逐项填写中国兽医药品监察所“检验记录”首页。
9.6.1.2对照品名称、来源、批号、含量。
9.6.1.3储备液、工作液及对照溶液制备及制备日期。
9.6.1.4试料制备、提取、净化、测定(包括测定过程中涉及的计量仪器编号)。
9.6.1.5原始数据(包括仪器测定图谱和打印的数据)。
9.6.1.6计算公式及计算过程(软件计算除外)。
9.6.2计算
按下式计算试料中环丙氨嗪和三聚氰胺的残留量：
式中：
X――试料中环丙氨嗪或三聚氰胺的残留量(μg/kg)；
A――试样溶液中环丙氨嗪或三聚氰胺的峰面积；
As――标准溶液中环丙氨嗪或三聚氰胺的峰面积；
cs――标准溶液中环丙氨嗪或三聚氰胺的浓度(μg/L)；
V――溶解残余物的体积(mL)；
m――供试试料的质量(g)。 、
(注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字)
9.6.3结果判定
9.6.3.1 线性范围 在2.5～100μg/L浓度范围内考察线性，计算回归方程，其相关系数R2>0.998。
9.6.3.2准确度 本方法在10～100μg/kg添加浓度的回收率为70％～120％。
9.6.3.3精密度 本方法的批内变异系数≤20％，批间变异系数≤20％。
若方法学考察符合以上规定，则供试组织中药物的残留量之和 <检测限时，判定为未检出；检测限≤ <最高残留限量时，判定为符合规定； ≥最高残留限量时，判定为不符合规定。
10、附加说明
10.1 本标准操作规程依据本实验室验证资料制定。
10.2环丙氨嗪的最高残留限量：
参考资料：兽药残留检测标准操作规程
