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色谱一原子荧光光度计联用技术的新进展及其在食品、环境领域中的应用
发布时间：2017-09-01
1概述
随着科学技术的发展，痕量元素形态分析在食品安全、环境科学、临床医学，毒理学和营养学等诸多领域对有毒有害有机金属污染物引起高度重视。人们已越来越认识到砷、汞和硒的不同化合物之间毒性存在巨大差异，且其毒性不仅与元素总量有关，还与元素存在形态密切相关。例如，无机砷化合物(包括三价砷和五价砷)毒性最强，一次过量摄人可引起急性中毒，长期低剂量暴露可引起慢性砷中毒，诱发各种皮肤病及肝肾功能受损，甚至导致癌症。而甲基砷酸化合物毒性则较低，在广泛存在水生生物体内的砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)、砷糖(AsS)等形态砷化物通常被认为毒性很低或无毒””，;而二价无机汞和甲基汞作为汞元素的主要存在形态，甲基汞的毒性要比二价无机汞大得多，甲基汞能够穿透生物膜，并通过食物链进行富集，对人和动物的危害最大‘3.‘，;硒是人和动物所必需元素，但是过量吸人六价无机硒会导致生物体中毒反应，而有机硒化合物硒代胧氨酸(SeCyS)则有延缓衰老功效和抗癌作用‘sl。元素的不同存在形态决定了其在环境和生命过程中表现出不同的行为;不同的元素形态由于具有不同的物理化学性质和生物活性，在环境和生命科学领域发挥着不同的作用。元素总量或者浓度的相关信息已经不能满足环境和生命科学研究的需要，有时候甚至会给出一些错误的信息。根据传统分析方法所提供的元素总量的信息已经不能对某一元素的毒性、生物效应以及对环境的影响做出科学的评价，为此，分析工作者必须提供元素的不同存在形态的相关信息。元素形态具有多样性、易变性、迁移性等不同于常规分析对象的特点，因此其分析方法也成为一个崭新的研究领域，即“元素形态分析”。
联用技术是元素形态分析主要分析手段，是指将不同元素形态的分离与测定结合为一体，实现样品中元素不形态的在线分离与测定。联用技术由于可以实现在线的有效分离与测定，因此已成为目前元素形态分析的主要手段。分离部分主要以色谱和高效毛细管电泳为主，检测部分主要是原子光谱/质谱类仪器，此外联用技术还包括一些特殊的接口、特殊的样品引人技术以及在线样品前处理技术等。
HPLC / GC一ICP -MS联用技术已经成为分析化学中最热门的研究领域之一，被认为是目前最有效和最有发展前景的形态分析技术，在国外得到了较为广泛的应用。但是，I CP - MS存在同量异位素、多原子分子离子以及多电荷离子的干扰问题，如00Ar'SC 1干扰’SAs , 00Ar00Ar干扰}0Se , '}Ar'80干扰“Fe的测定。ICP -MS对色谱分离中所普遍使用的高盐组分和高含量有机组分，如甲醇、乙睛等承受能力有限，大大限制了其在与色谱联用中的应用。此外，I CP - MS昂贵的价格、对操作人员的较高要求以及极高的运行和维护成本限制了ICP一MS在元素形态分析领域的广泛推广和应用。VG一AFS作为一种高灵敏的分析技术在砷、汞、硒等元素分析具有独特优势，在与色谱联用具有无可比拟的最佳效果，可以与HPLC一ICP一MS联用相媲美。
早在1998年，北京瑞利分析仪器公司先后与中科院生态环境研究中心和美国戴安公司合作开发色谱与原子荧光光度计联用系统，旨在建立砷、汞和硒等元素的形态分析方法。近年来，此项研究工作取得了突破性的进展，实现了HPLC一AFS和IC一AFS两种联用技术的分析仪器的商品化。2006-2008年，瑞利公司又与中国疾病预防控制中心营养与食品安全所合作，完成了“十一五”国家科技支撑计划重大项目2006BAK02A 10《食品安全关键技术一持久性有毒污染物检测技术研究》即液相色谱一原子荧光联用技术研究，突破了色谱一原子荧光联用平台中的关键技术瓶颈，为元素形态分析技术在食品安全领域的应用提供了商品化的液相色谱一原子荧光联用仪器。同时，瑞利公司即将完成的“十一五”国家科技支撑计划重大项目2006BAK03A14《监测检测专用仪器产业化示范的色谱一原子荧光联用仪》，其产出成果已经批量上市，以满足元素形态分析仪器的需求。这些项目对我国元素形态分析的发展起到积极的推动作用。本文将此项研究成果及其应用作一简介。
2色谱与原子荧光光度计分析联用技术的特点
在上世纪80年代初，蒸气发生一原子荧光光度计(VG-AFP )在我国诞生(6)。它集蒸气发生技术和结构简单的无色散原子荧光光度计等诸多优势技术于一体，利用蒸气发生技术使分析元素与基体元素分离，并得到富集，而生成的蒸气发生元素可以在氢氢火焰中原子化，而氢氢火焰本身具有很高的荧光效率及较低的背景发射干扰。因此，VG一AFS在测定As ,瑰、Se, Pb和Cd等典型有毒有害元素方。面具有很高的分析灵敏度，优于AAS , I CP一AES等现代原子光谱的分析手段，在我国很快得到推广和普及17一’。
我国科技工作者经过近30年的努力，不断改进和创新，VG一AFP有了很大的发展，由早期仅能分析5一6个元素，现已扩到11个;分析灵敏度提高了1一2个数量级;重现性由5%提高到1%，由手工操作发展到智能化全自动测定，走上了一条快速发展的道路，具有典型中国特色的VG - AFP，如“低温原子化”和“自动排出废液的气液分离装置”等【””2]。新技术均已处于国际领先水平。
原子荧光光度计是具有中国特色的分析仪器，它具有分析灵敏度高、线性范围宽、仪器结构简单、成本低廉、易于维护、光谱干扰及化学干扰少等独特优点。对于As ,瑰、Se, Pb等元素的特征谱线均处于原子荧光最佳的检测波长范围，在采用了高效的蒸气发生进样技术后，具有很好的检出能力，可以获得与电感祸合等离子体质谱(ICP一MS)相当的检出限和灵敏度。蒸气发生进样技术能够使待测组分与基体有效分离，因此具有极强的耐高盐组分和有机组分的能力，能够和任何的色谱分离条件相匹配。此外原子荧光还具有成本低廉和操作简单等优点，使得HPLC一VG一AFP联用技术应用于元素形态分析具有极大的发展前景，易于得到推广。
3色谱与原子荧光光度计联用技术关键部件的研究
3.1高效的紫外光(W)在线消解接口
色谱与原子荧光光谱联用技术的核心是两者之间连接的“媒介”即接口技术。VG - AFP中蒸气发生进样技术对元素的价态和形态具有较高的选择性。一般而言，对高价态以及有机结合态的蒸气发生效率相对较低。
可见，对于砷甜菜碱和砷糖的测定，则需要在经过色谱分离后，通过在线紫外消解，转化为五价砷，再进行蒸气发生，才能最终被原子荧光所检测。因此，在蒸气发生前需要对样品进行在线氧化处理，即将色谱分离后待测元素形态转变为易于蒸气发生的形态，以获得较高的进样效率。常用的在线接口一般为紫外线消解系统和微波加热消解系统，微波加热消解系统由于反应剧烈，加热温度较高，容易造成紊流和压力过高，影响分离效果并造成系统噪声增加，该法已经逐渐被淘汰。而紫外线消解系统则相对较为温和，利用紫外线诱导产生的自由基发生氧化或还原作用，使得有机态的元素形态转化为无机离子，高价态的元素形态转化为低价态。因此，紫外光(W)在线消解系统是联用技术中的关键部件，我们研制成功的消解系统装置具有以下特点:
(1)采用新颖的机械结构和防震措施，重点解决了紫外灯管使用石英材料易破碎的技术难题。且完全可以满足国家标准GB 11606一2007对分析仪器的关于碰撞、跌落、颠簸、振动、冲击等方面的考核要求。即使在最苛刻的环境试验条件下，紫外灯也不会破碎。
(2)采用了系统恒温控制技术，确保灯管温度维持在最大发光强度和最佳恒定温度，保证了紫外光强度长期稳定的优异性能。
(3)采用具有最高紫外线反射率的特种材料和双曲面型反射装置，极大地提高了紫外线的辐射强度和利用率、从而提高了紫外消解系统的的消解效率。
(4)采用具有较高紫外透过率的聚四氟乙烯(PTEE)管，取代了易碎和怕碱性溶液腐蚀的石英管，这种新型反应管，能够承受任意类型消解溶液的腐蚀，管路长度和内径均经过理论计算和系统测试，有效抑制了峰展宽，可得到极佳的分析结果。
(5)为确保操作安全性，防止紫外线直接或间接与人体接触，本系统采用全封闭一体化的结构设计，保证无任何紫外光泄漏，以及长期运行也不会产生臭氧。
3.2全新的蒸气发生气一液分离器
蒸气发生气液分离器是色谱与原子荧光光度计联用技术中重要组成部分，其主要作用为将蒸气发生反应过程中生成的气态物质与反应后的溶液分离。联用技术元素形态分析的模式与总量分析不同，色谱分离所使用的试剂种类较多，基体组分也比较复杂，且元素形态分析的样品单次测定时间一般长达几分钟、十几分钟，甚至更长时间，而在长时间蒸气发生反应过程中，载气以及反应过程中生成的氢气极易将大量的水蒸气携带进人原子化器并在其上方形成微珠，进而引起显著的荧光碎灭和光散射，对荧光信号的测定产生严重的影响，同时，较多水蒸气凝结后还易造成阻碍管道中气体的传输，从而严重影响分析灵敏度和重现性。
我们研制成功了一种卧式的喷流型三级气一液分离器，经过色谱分离的组分再经过紫外消解和酸化后，与还原剂混合反应，直接进人喷流器，由载气经喷流器在其出口处产生负压，加速复杂基体组分的蒸气发生反应，在气一液分离的内层进行一级分离，废液直接流人底部U形管水封后自动排除，将含有少量的水蒸气的气体进人外层进行二次分离，气体由上部出口再次通过三级气一液分离装置，使含有的细微水气再次分离，然后进人原子化器原子化。它的优点是氢化反应完全，气一液分离彻底，特别是有机质较高的样品产生较多泡沫时仍具有良好的气一液分离效果。在色谱一原子荧光联用过程中，色谱分离条件中较多采用容易产生大量泡沫的离子对试剂和甲醇、乙睛等易于产生荧光碎灭的有机溶剂，该气液分离器发挥了重要作用，在最大程度上可将有机溶剂和氢化物有效分离，同时有效抑制泡沫的生成。
3.3升级联用技术的通用接口装置
当前VG一AFS的商品仪器一般都是仅能测定As,瑰、Se和Pb等元素的总量分析。如果用户需要开展元素形态分析，则还需要另外购买专用的色谱与原子荧光光度计联用分析仪，这对于已有液相色谱或离子色谱的实验室，则是极大的浪费。为了适应用户的需求，本公司针对现有的VG一AFP总量分析的产品，开发出能够与国内外的各种液相色谱或离子色谱联用的PDI一10型通用接口装置，无需更改硬件，可以直接将原子荧光光度计与液相色谱或离子色谱连接，即可升级为联用技术元素形态分析仪。这种整体结构的通用接口装置，包括蠕动泵、旋转阀、紫外消解系统和专用控制终端软件等。脱离接口装置，同时仍具有As ,掩、Se等11种元素总量分析功能。
3.4联用技术专用的工作站软件
色谱一原子荧光联用技术控制方式在发展的最早期，一般通过不同的软件或单片机，分别控制色谱泵、紫外消解系统及原子荧光，数据采集一般依靠专用的色谱工作站软件或其它软件来完成，甚至数据的处理和数据及分析报告的输出均需要额外的软件来实现，操作的繁琐和复杂程度很难让广大的分析工作者接受。而且在软硬件配合上也没有经过系统优化设计，稳定性较差。
我们编制了专门针对液相色谱/离子色谱一原子荧光联用技术平台的工作站软件Pro Hyphen，率先实现了联用技术的整机一体化控制，同时对仪器硬件作出系统调整，完成了联用仪器多个单元的一体化系统控制，大大提高了联用系统的稳定性和可靠性。该工作站软件可同时实现对整机的系统控制，数据采集与处理等功能，适合分析实验室使用，从而保障了仪器的商品化。
3.5任何过程汞分析的安全保障装置
汞元素在氢化物反应过程中，比任何元素都易于生成汞蒸气，因此，在原子荧光测量过程中，无论是否测量汞元素，均会有汞蒸气生成，而且是样品中100%的汞蒸气生成。由原子化器上方排出的原子态的汞蒸气是一个潜在的污染源，需格外注意。由于汞蒸气密度较大，在不影响测量的前提下，最好的通风装置也仅能将30%的汞蒸气排出实验室，其余70%存留在原子化室中，长期累积，逐渐向实验室内部扩散，危害操作人员身体健康。针对上述的情况，汞蒸气的捕集装置为首选解决方案，分为主动式和被动式两种，主动式为采用气体循环的方式主动吸附、捕集汞蒸气;被动式为捕集静止固定于某一位置，仅仅依靠气体自由扩散进行吸附。我们经多年的刻苦攻关，于2005年初申请了“主动式捕集装置”专利(专利号:200520000097.2)，在业内率先提出“环保型原子荧光”的理念，引起广泛关注，并获得2005年的原子荧光产品的唯一BCEIA金奖。采用流量为25L的大流量抽气泵和大容量高效能汞吸附剂，能够使容积为3.9L的原子化室中的气体在1分钟内循环达6次之多，捕集效率高达70%。其汞蒸气的捕集效果远远高于被动式捕集装置。
4商品化的色谱一原子荧光光度计联用仪器
4 .1 AF - 61 OD2色谱一原子荧光光度计联用仪
本公司自1998年就开始进行色谱一原子荧光联用技术的自主研发，实现了所有关键技术的突破，为形态分析仪器商品化的研制打下了坚实的技术基础。2006年正式立项，开始了AF - 610D色谱一原子荧光联用仪的研制，并得到国家相关部门的高度重视，先后获得了两项“十一五”国家科技支撑计划的项目支持，从而加快了AF - 610D色谱一原子荧光联用仪器的开发推广和商品化进程，满足了市场对元素形态分析仪器的需求。而后，结合自身在联用技术领域的技术优势，开发出新了一代的AF - 610D2色谱一原子荧光光度计联用仪。整机同时具备总量分析和形态分析的功能，无论是在整机控制、性能参数还是在技术水平上均达到国际先进水平。
4 . 2 AF - 610D2色谱一原子荧光光度计联用仪的分析谱图
4.2.1砷形态分离谱图
4.2.1.1三价无机砷(As(III))、五价无机砷(As(V))、一甲基砷(DMA)和二甲基砷(MMA)
As(川)、As( V ) , DMA和MMA四种砷形态，浓度分别为10, 100, 500, 1000ng / mL，采用阴离子交换柱进行分离后，原子荧光进行检测，其重叠谱图如图3所示。
4.2.1.2砷甜菜碱(AsB)、五价无机砷(As(V))、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)
AsB, As(V), DMA和MMA四种砷形态，浓度分别为10, 100, 500, 1000ng / mL，采用阴离子交换柱进行分离后，原子荧光进行检测，其重叠谱图如图4所示。
4.2.1.3阿散酸、2一硝基苯基砷酸和洛克沙肿
阿散酸(PASA ) , 2一硝基苯基砷酸(NPAA)和洛克沙肿(NEiPAA )，浓度分别为10, 50, 100, 500,1000, 2000ng / mL，采用C18柱进行分离后，经过在线紫外消解后，原子荧光进行检测，其重叠谱图如图5所示。
4.2.2汞形态分离谱图
甲基汞(MMC )、乙基汞(EMC )、苯基汞(PMC )、二价无机汞(MC )，浓度分别为0.05, 0.1, 0.5,1, 5, long/mL，采用C18柱进行分离后，经过在线紫外消解后，原子荧光进行检测。
4.2.2硒形态分离谱图
浓度均为l Ong / }L的硒代肤氨酸(SeCys)、亚硒酸盐(Se(IV))、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒酸盐( Se( VI ) )，在采用阴离子交换柱分离后，经过在线紫外消解还原，原子荧光检测。
5色谱与原子荧光联用在砷和汞等元素形态分析中的应用
5.1 HPLC-W-VG-AFP联用测定海产品中无机砷
近年来，国内外针对色谱与低成本、高灵敏的元素特效检测器，蒸气发生一原子荧光光度计(VG- AFP)联用引起关注。该方法已用于啤酒‘I3]，农田土壤[14]和植物‘IS，等，以及不同环境生物样品中砷的形态分析。
中国疾控中心营养与食品安全所张磊、李筱薇、赵云峰等[16]报道了以20mmol / L磷酸二氢钱(PH6川为流动相，以Ham i 1 ton PRPX-100阴离子柱进行无机砷、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA )有效分离。采用高效液相色谱一紫外消解一蒸气发生一原子荧光光谱法(HPLC-W-VG-AFP)测定海产品(海藻)中无机砷含量，方法特异性强，结果准确可靠。
5 .1 .1仪器装置与条件
Agilent1200高效液相色谱(美国Agilent公司);Ham i 1 ton PRPX-100阴离子交换色谱分析柱和预柱(美国Hamilton公司);AF一610D原子荧光光谱仪(北京瑞利分析仪器公司)
HPLC主要参数:20mmo1 / L磷酸二氢钱溶液(PH6.0)为流动相，等度洗脱，流速1.OmL/min,进样体积100NLo
AFP主要参数:负高压320V;空心阴极灯总电流90mA(主电流/辅助电流:55 / 35mA );载流:2 .4mol/LHC1;流量4mL/min; 3%(m/v ) KBH<溶液，流量4mL/minx
5.1.2分析结果
海藻样品以2mol / L三氟乙酸(TFA)溶液为提取剂，热浸提2h后，采用高效液相色谱‘~原子荧光光谱法测定无机砷的总量为68 . 3mg / kg。参加了FAPAS国际上26个实验室比对考核，得到Z评分为0.3(实验室编号为19，见图8)，取得了优异成绩，证明该法结果的特异性强，准确可靠。
5.2 IC-W V}AFP联用测定生物样品中汞化合物形态
色谱与各种检测器联用是较为普遍采用的分析汞化合物形态的方法，常用的检测器有冷蒸气发生一原子吸收光谱检测器‘”，、原子发射光谱检测器‘I8]及化学检测器‘19]等，但方法灵敏度较低，不能满足食品、生物样品中痕量分析的要求。电感祸合等离子体一质谱检测器具有较高的灵敏度，然而昂贵的设备限制了该方法的应用。
中科院生态环境研究中心墨淑敏，梁丽娜等‘ml报道了淋洗液为含5% (V/V)乙腊、60mmo1 / L醋酸胺和0.01% (V/V)二硫基乙醇的水溶液，以,Acclaim polarAdvantage C16分析柱，进行了无机汞，甲基汞和乙基汞有效分离。采用离子色谱一紫外消解一蒸气发生一原子荧光光谱法(I C-W-VG-AFP)测定脉红螺样品中汞化合物形态，取得了满意的分析结果。
5.2.1仪器装置与条件
I CS-1500离子色谱(美国戴安公司);AF-610D原子荧光光度计(北京瑞利分析仪器公司)。
IC主要参数:淋洗液的流速1mL/min，进样体积25uLe
AFS主要参数:负高压:280V;空心阴极灯灯电流:30mA;氢气流量:400mL / min;
5.2.2分析结果
浓度分别为10和100ug/L混标溶液的分离谱图如图9所示。在优化分离检测条件下，20ug/L的汞化合物标准溶液平行7次测定，甲基汞，无机汞和乙基汞的相对标准偏差(RSD)分别为2.0%,2.9%和2.4%;三种汞化合物的线性范围为10一2000 u g / L; 25 u 1进样检出限分别为3ug/L, 2ug/L和4ug/L。用建立的方法测定脉红螺样品中甲基汞和乙基汞的加标回收率分别为90%和92%。
5 . 3 GC AFP连用测定生物和沉积物样品中甲基汞
气相色谱(GC)与原子荧光光谱(AFP)联用测定汞化合物形态的研究比较少，气相色谱法用于元素形态分析的主要目标分析物为挥发性或稳定性的物质或可以通过衍生物反应转变为挥发性物质，因此在形态分析中的研究主要是有机汞，有机铅和有机锡等沸点较低且热稳定性较好的物质。瑞利公司与中科院生态中心合作开发了GC AFS联用系统。如图10所示，加热器的作用是将有机汞转化为无机汞，主要由一段缠有镍铬电阻丝的石英管(长15cm，内径lmm)组成。系统工作时，电阻丝两端输人一定电压使其温度恒定在850 C，用一段长30cm，内径0.53mm的石英毛细管连接色谱柱与聚四氟乙烯(PTFE)管，可消除汞化合物的吸附及扩散。尾吹气的作用是将分析物迅速带人检测器。
5.3.1仪器装置与条件
HP6890气相色谱仪(美国Hewlett一Packard公司);SE一30毛细管色谱柱(北京北分天普仪器技术有限公司);AF一620原子荧光光度计(北京瑞利分析仪器公司)。
GC主要参数:进样口温度:300 C;进样体积:5 u 1;载气流量: 8mL / min;加热器温度:850℃。
AFP主要参数:负高压:400V;灯电流SOmA;尾吹气:120mL / min;氢气流量:400mL / min o
5.3.2分析结果
在优化分离检测条件下，浓度均为20ng / mL的甲基汞和乙基汞的分离谱图如图11所示，其保留时间分别为甲基汞2.96min，乙基汞3.76min。甲基汞(MMC )和乙基汞(EMC)的绝对检出限(3a)可达0 .OOSng。对于long/ mL的MMC和EMC标准溶液，连续5次测定精密度(RSD)分别为2.5%和1.3%;标准参考物(DORM一2)的分析结果与标准值一致。本法对采自太湖梅梁湾的鲤鱼、鳃鱼、细鱼和蚌四个生物样及三个沉积物样品中的甲基汞进行了分析，取得了满意结果。
摘自：中国计量测控网
