首页>技术中心>技术资讯>新型多通道共焦激光诱导荧光检测系统
新型多通道共焦激光诱导荧光检测系统
发布时间：2017-09-01
引言
由于具有分离效率高、分析速度快和样品体积小等特点[1-3]，毛细管电泳被广泛应用于医学、生物、分析化学等领域。为了实现高通量的DNA 样本分析，可以将多根毛细管组成阵列，形成毛细管阵列电泳[4]。应用于毛细管阵列的荧光检测技术， 主要分为两大类[5-6]：一类是基于面阵图像传感器的成像式非扫描检测，主要采用制冷CCD 作为光探测器。另一类是基于点探测器的共焦扫描检测，主要采用光电倍增管(PMT)等作为光探测器。基于CCD 的检测系统需要对CCD 进行制冷以获得较好的信噪比， 其造价高且灵敏度低;而基于PMT 的点扫描系统一般将毛细管阵列固定在扫描平台上，通过扫描平台的运动实现扫描，其工作稳定性相对低且工作噪声大[7]。
设计了新型的基于点探测器的共焦扫描激光诱导荧光检测系统，以PMT 为光探测器，通过振镜的扫描实现多通道毛细管阵列的荧光激发与接收，实现高通量的DNA 分析。文中主要分析该新型扫描系统的设计需求，并给出相应的设计与性能测试结果。
1 系统总体结构及设计要求
新型多通道共焦激光诱导荧光检测系统结构如图1 所示。
具体工作过程如下： 固体激光器1 发射的激光束(488 nm) 经扩束镜组2 扩束后直径略小于2 mm，反射镜3 将其反射后穿过反射镜4 中心的小孔(小孔直径为2 mm)到达振镜5。振镜与f-theta 物镜组6 构成动光式扫描机构，实现对毛细管阵列7 的扫描。毛细管中经过染料标记的DNA 片段在激光的激发下发射出的荧光信号， 由相同的f-theta 物镜6 收集后成平行光束，经振镜5 反射后，反射镜4 将荧光信号反射，与激发光路分开，经反射镜8 反射进入会聚透镜9，会聚后的荧光信号通过共焦小孔11 到达PMT12，由PMT 检测后输出至后端的嵌入式系统中进行相应处理。PMT前放置多色滤色片轮10，由步进电机驱动，以固定的速率转动，仅使用单个PMT 就实现了多色荧光信号的检测，简化系统结构，缩小仪器体积，同时降低成本。由于采用共焦结构，减小了背景荧光及杂散光的影响，提高了系统的信噪比。
1.1 光学扫描结构选择及f-theta 物镜设计
新型系统采用以电磁扭力为驱动的振镜作为扫描器件，加上特殊设计的大视场f-theta 物镜，实现毛细管阵列的线性扫描。由于振镜扫描轻便，无摩擦力，无运动导轨，避免了直线驱动，扫描惯量小，提高了扫描的效率，相比于通过扫描平台的运动实现的扫描，其机械噪声得到降低，同时检测灵敏度也得到了提高。光学扫描根据扫描机构的位置分为物镜前扫描和物镜后扫描[8]。物镜后扫描的优点是物镜的口径相对较小，扫描物镜只要求校正轴上点像差即可。其缺点是扫描像面为一曲面，不适用于排列成平面的毛细管阵列电泳系统，故本系统采用物镜前扫描方式。f-theta 物镜的轴上点和轴外点应具有相同的成像质量和扫描点大小，为此， f-theta 物镜除严格校正轴上和轴外点的像差外， 还应满足无渐晕和平像场的设计要求。另外，系统的激发光与多色荧光信号通过相同的f-theta 物镜，因此，还需要对物镜进行色差校正。在设计f-theta 物镜时， 首先确定系统的外形参数。根据像高y 与物镜焦距f′和视场角2θ 的关系：y=f′θ (1)
系统要求能并行检测48 根毛细管， 毛细管紧密排列，其外径为375 μm， 故物镜的扫描区域应不小于48×375 μm=18 mm ，设计时保留一定余量，取像方视场为20 mm，即y=10 mm。由于系统的检测灵敏度与数值孔径有直接关系，数值孔径越大，灵敏度越高[9]，而焦距的增大会使系统所能承担的数值孔径减小。另一方面，增大视场角会增加像差的校正难度，因此，综合考虑上述两个因素后，确定系统的焦距f′为36.5 mm，视场角2θ为0.55 rad。选取初始结构后，通过光学设计软件进行优化，最终f-theta 物镜的焦距为36.5 mm，入瞳直径为20.44 mm，系统总长为148 mm。荧光收集的数值孔径达0.28。
1.2 反射镜4 中心小孔孔径的确定
激发光通过位于反射镜4 中心的小孔入射， 同时， 毛细管中经染料标记的DNA 片段激发出来的荧光信号也需经反射镜4 反射后由PMT 检测，因此，该小孔的存在会损失部分荧光能量，造成系统检测灵敏度下降。f-theta 物镜收集孔径角内的荧光光强可以认为是均匀分布的，因此，损失的荧光能量与小孔直径D 的平方成正比。减小小孔的尺寸可以改善系统的检测灵敏度。
反射镜4 中心小孔的尺寸取决于所要通过的激光光束的直径，而激光光束的直径与系统的分辨率有关。根据衍射理论，衍射光斑的直径d 为：
式中：k 为与通光孔形状有关的值， 这里通光孔为圆形，故k=2.44; λ 为入射光波长， 等于488 nm; D 为小孔直径，即为激光光束的直径。根据参考文献[10]可知，激发光斑尺寸增大对于激发毛细管中的荧光信号有所改善，但为了使采样信号能在整个激发光斑照射毛细管内径时进行采样，实际系统中激发光斑小于毛细管内径(i.d. = 50 μm)。实际系统中激发光斑直径为30 μm 。根据公式(2)可得：D≈1.45 mm 。由于实际应用过程中，毛细管阵列平面可能会存在离焦量导致激发光斑变大，故实际系统中取D=2 mm 。
2 振镜离焦对荧光收集效率的影响
2.1 振镜离焦对激发光路的影响
为了保证物镜前扫描系统在扫描像面上得到均匀的像面照度， 使整个视场具有相同的激发光强，扫描物镜一般设计成像方远心光路，使其像方主光线始终垂直于扫描像平面[11]，即要求将振镜的转动轴心与扫描物镜的物方焦点重合。由于系统在制造、安装过程中的误差不可避免，而且由于振镜的转轴一般在振镜反射镜的中心，因此，反射镜的转动过程不可避免地会引入离焦。
对于激发光路， 振镜的离焦将造成激发光的主光线不再垂直于由毛细管阵列组成的平面，如图2 所示。
其中位置1 表示物镜焦点处，位置2 和位置3 分别表示振镜的正离焦和负离焦。设离焦量为△f ，振镜与光轴的夹角为α ， 则离焦引起的主光线偏离光轴高度为-△y =△f×tan(-α) ，此时，入射的激发光与毛细管阵列平面的法线之间的夹角β=arctan(-△y/f′)=-arctan(△f×tanα/f′) 。由于视场角最大为±0.27 rad ，对应的振镜与光轴的夹角α 变化范围为37.5°~52.5°。图3 给出了不同的离焦量时， α 与β 之间的关系曲线。
可以看出：振镜位置的正负离焦对β 的影响是一样的，离焦量越大，β 越大。当离焦一定时， β 将随着α 的增大而增大，而且增大趋势随着离焦量的增加而变快。参考文献[12]指出由激发光束激发的荧光并非完全各向同性， 而是沿光轴的毛细管中心剖面成对称分布，其中沿光轴方向荧光强度最大，垂直方向荧光强度最小，变化在6.5%以内。由于激发光入射角的不同，则处于荧光收集角内的荧光信号分布将发生变化， 入射角越大，处于荧光收集角内的荧光信号越弱，即荧光收集效率变低。对于同一离焦量，荧光收集效率随着α 的增大而变小。对于不同的离焦量，荧光收集效率随着离焦量的增大而减小。荧光收集效率对于系统灵敏度有直接关系，离焦会造成灵敏度的下降，应该尽量避免。
2.2 振镜离焦对荧光收集光路的影响
将图1 中的系统按实际尺寸在光学仿真软件TraceproR 中建立仿真模型，其中，由激光激发的荧光信号使用Lambertian 光源代替，使得整个f-theta 物镜视场中的荧光信号强度一致， 光源尺寸为30 μm，与实际激发光源的光斑大小一致， 将固体激光器1、扩束镜组2 及反射镜3 省略，并在会聚透镜前建立一个虚拟平面用于检测系统收集到的荧光信号。
仿真步骤如下：将振镜放置于f-theta 物镜的像方焦点处，根据振镜的偏转角度不同，在物方焦平面的相应位置放置Lambertian 光源， 其发出的光线经ftheta物镜收集， 并由振镜及反射镜反射到虚拟观察平面。改变振镜与光轴的夹角，重复上述的过程，测量整个视场中其他位置的荧光收集效率。改变振镜的位置使其离焦，按照前面的方法测量不同的离焦量时系统的荧光收集效率。
定义荧光收集效率不均匀度(FCENU)为整个视场中各视场角对应的荧光收集效率(Fi)的标准差与平均值(F)之比，即：
式中：i=0，1,…,n-1 。
图4 为归一化荧光收集效率的仿真结果，振镜正离焦距离越大，系统荧光收集效率均匀度越好。表1给出了不同离焦情况下的荧光收集效率不均匀度。当振镜从正离焦5 mm 变到负离焦5 mm 时， 荧光收集效率不均匀度从4.58%增加到9.54%。
3 实验结果
通过电子目镜观察视场中心与视场边缘的会聚光斑尺寸大小。观察到的光斑如图5 所示，图5 (a)为视场中心的光斑，图5 (b)为边缘视场的光斑。可以看出：视场中心的会聚光斑约为30 μm ，光斑形状较好且较亮。视场边缘的光斑尺寸略有变大，整体亮度有所下降。
荧光收集效率检测的具体过程：针对毛细管阵列中每根毛细管， 通过燃烧方式制作荧光检测窗口，注入相同浓度的罗丹明溶液。实验结果如图6 所示。实验结果表明： 荧光收集效率与理论分析的结果一致。局部范围内，荧光收集效率变化较大，且整体不均匀度较仿真结果(6.92%)偏大，达到7.61%。原因可以归结为两方面：首先，实际系统在安装调试过程中存在一定的误差，使得实际系统与理论系统之间存在一定的差异;其次，由于实验用毛细管的处理可能存在瑕疵， 使得入射到每根毛细管内径的激发光能量不一致，导致荧光收集效率变化。
4 结论
对动光式共焦扫描激光诱导荧光检测系统进行理论及仿真分析，指导f-theta 物镜的设计，确定了反射镜中心的小孔尺寸，减小了荧光损失。对于振镜的离焦对系统荧光收集效率的不均匀度进行了理论分析，从激发光路及荧光收集光路两方面入手。对于激发光路， 发现当振镜的离焦量增大时， f-theta 物镜所能收集到的荧光信号整体变弱，这将影响系统的检测灵敏度，同时，荧光收集效率不均匀度将增大。而对于荧光收集光路，则是振镜越接近物镜，荧光收集效率均匀度越好。实验结果表明：该新型多通道共焦扫描激光诱导荧光检测系统符合设计要求。
摘自：中国计量测控网
