单端孢霉烯族化合物（二）
发布时间：2017-09-01
(2)测定
①薄层板的制备。称取硅胶G4g，加水10mL于乳钵中，研磨至糊状后，立即倒人涂布器内，制成5cm×10cm、厚度为0．3mm的薄层板3块，在空气中干燥15min后，在105～110℃活化2～3h，取出放干燥器中保存。
②点样。用10μL微量注射器在一块5cm×10cm的硅胶G薄层板上距下端1cm处点3点：标准溶液10μL、样品提取液10μL、样品提取液10μL加标准液10pL。边点样边用吹风机吹干，点上一滴吹干后再继续滴加。
③展开。在展开槽内加乙酸乙酯-甲苯(3+1)15mL，将薄层板浸入溶剂中，展至18cm，取出挥干。
④显荧光。于薄层板上喷上一层均匀、湿度合适的20％硫酸甲醇溶液，置110℃下10min，取出后在紫外光分析仪下观察。
⑤观察与评定。将薄层板置紫外光分析仪下，同时应用长波紫外光(365nm)和短波紫外光(275nm)观察。如样液点处与标准点相近位置上未出现蓝色荧光点，则样品中T-2毒素的含量在方法灵敏度200μg／kg以下；若出现荧光点的强度与标准点的最低检出量的荧光强度相等，且此荧光点与加入内标的点重叠，则样品中T-2毒素含量为200μg／kg；若出现荧光点的强度比标准点的最低检出量强，则据其荧光强度估计减少滴加的体积(μL)，或将样液稀释后再加不同体积(μL)，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。
4、计算
式中0.04――T-2毒素最低检出量，μg；
V1――加入丙酮的体积，mL；
V2――出现最低荧光时滴加样液的体积，mL；
n――样液的总稀释倍数；
m――丙酮溶解时相当样品的质量，g。
(二)小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的测定
1、原理
小麦中DON经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使DON在365nm紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较定量。
2、试剂
DON标准溶液：精密称取5mg DON，加乙酸乙酯溶液后转入10mL容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度。此标准溶液含DON 0.5mg／mL。吸取此标准溶液0.5mL，用乙酸乙酯稀释至10mL，此溶液每毫升含DON 25μg。
3、测定
(1)提取称取20g粉碎的小麦样品，置于200mL具塞锥形瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇(8+2)，密塞，在瓶塞上涂上一层水盖严防漏，振荡lh，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25mL滤液于75mL玻璃蒸发皿中，置80～90℃水浴上通风挥干。用40mL正己烷分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入lOOmL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水(4+1)分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中，振摇1.5min，静置约15min，使分层后，将下层甲醇-水提取液过柱净化，不要将两相交界处的白色絮状物放入柱内。
(2)净化 在层析柱下端与小管相连接处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧。先装入0.5g中性氧化铝。敲平表面，再加入0.4g活性炭，敲紧。将层析柱下端小管插入一橡皮塞，塞在抽滤瓶上，抽滤瓶中放一平底管接收过柱液。将抽滤瓶接上水泵或真空泵，稍稍开启泵使活性炭压紧。将分液漏斗中的甲醇一水提取液小心沿管壁加入柱内，控制流速为每15s 18～20滴。甲醇一水提取液过柱快完毕时，加入10mL甲醇一水(4+1)淋洗柱抽滤，直至柱内不再有液体流出，使30mL液体在10～11min内过柱完毕。过柱速度要均匀，不要时快时慢。
(3)制备薄层层析用样液 将过柱后的洗脱液倒入75mL玻璃蒸发皿中，用少量甲醇-水(4+1)洗涤平底管。将蒸发皿置沸水浴上浓缩至干(约40min)，趁热加入3mL乙酸乙酯，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次，使充分沸腾，将残渣中的DON溶出(如乙酸乙酯溶液太少或被挥干，可再加入适量)。放冷至室温后转入浓缩瓶中，再用3份l～5mL乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置约950C水浴上用蒸汽加热吹N。浓缩至干，放冷至室温后加入0～2mL三氯甲烷一乙腈(4+1)溶解残渣留作薄层层析用。
(4)薄层层析
①薄层板的制备。取4g硅胶G，加10mL 15％A1C13・6H2O水溶液，研磨约2～5min至呈黏稠状，铺成5cm×20cm的薄层板3块，置室温干燥后，于1050C活化1h，储于干燥器中备用。
②展开剂。横展剂为乙醚、乙醚-丙酮(95+5)、无水乙醚。其中任意一种，使样品DON点偏离原点0.7～1.Ocm，刚好与杂质荧光分开。纵展剂为三氯甲烷-丙酮-异丙醇(8+1+1)。
③点样。在每块薄层板上距下端2.5cm的基线上点样。
第一块板：对每一个样品，先点第一块薄层板。在距板左边缘O.8～1cm处点样液25μL，在距左边缘约2cm处点标准液lμL(25ng)，在距右边缘1．2cm处点标准液20μL(500ng)，再在薄层板上距上端3cm处的横线上，与下端基线上三点相对应的位置点3个DON标准点，各2μL(50ng)。DON的最低检出量达25ng，目视比较用50ng、75ng、100ng。薄层板经展开显荧光后，如阳性样品的DON点荧光强度小于500ng DON标准点，则不需要稀释，只要估计减少滴加量；如样品DON点荧光强度大于500ng标准点，需稀释后估计滴加量。
第二块板：在第一块板上未显荧光的样品，则需在第二块薄层板上距左边缘O．8～1．Ocm处滴加样液25μL加标准液1μL(25ng)，在距左边缘约2cm处滴加标准液2μL(50ng)。对阳性样品进行概略定量：在薄层板上距左边缘0.8～1.Ocm处滴加样液点(根据情况估计滴加量)，在距左边缘约2cm处和在距右边缘1.2cm处分别滴加两个标准点，DON量可为50ng、75ng、10Ong，根据情况选择滴加量。
④展开。展开槽均不先加入溶剂饱和。横展：在展开槽内倒入10mL横展剂，将点好样的薄层板靠样液点的长边斜浸入溶剂，展至板端，过1min取出，通风挥干5min。纵展：在展开槽内倒入10mL纵展剂，将横展挥干后的薄层板置展开槽内纵展13cm(约35min)，取出通风挥干10min。
⑤显荧光。先观察未加热的薄层板，可见到显蓝紫色荧光的干扰点(这时DON点不显荧光)，加热后它也显荧光，在DON点附近，但不干扰DON点。然后将此薄层板置130℃烘箱中加热7～10min，取出放在冷的表面上，1min后于365nm紫外光灯下观察。
⑥观察与评定。薄层板经横展后，板上的DON点都有移动，样品的DON点移动约0.7～1.Ocm，正是根据这一点在纵展后使样品DON点摆脱了杂质荧光的干扰。薄层板上端未经纵展的3个DON标准点可分别作为纵展后样品DON点和2个DON标准点的横向定位点。样品DON点又可与纵展后的DON标准点比较R1值而定性。这样从横向和纵向两个方面确定样品DON的位置，达到定性的目的。在第一块薄层板上如样品DON点上有很浅的斜的荧光通过，这是过柱时没有掌握好速度，净化不够，也可能是空气湿度的变化，影响分离效果，但两个标准DON点的位置上均无杂质荧光干扰。
如在第一块薄层板上样液未显荧光点，而在第二块薄层板上样液25μL加标准25ng所显荧光强度与标准25ng相等，则样品中DON含量为阴性或为50gg／kg以下。阳性样品概略定量时，虽然薄层板上3个DON点在横展中都稍有移动，但对各点荧光强度无影响，2个标准点均可用于和样品DON点比较荧光强度。
薄层光密度计测定：在薄层板上标准DON荧光点至少在100ng、200ng、400ng时，测得的响应与DON的量才呈线性关系。
对DON含量在300μg／kg以上的样品才用光密度计测定。当DON含量在300μg／kg时，点样液20μL使测得的DON的量落在10O～200ng之间。用薄层扫描仪测定时，每块薄层板上滴加2个标准DON点，DON的量为100ng、200ng或200ng、400ng。在激发波长340nm、发射波长400nm条件下进行测定，以测得的峰面积值为纵坐标，DON量为横坐标，绘制标准曲线。
4、计算
DON含量(mg／kg)
式中 A――薄层板上测得样品点上DON的量，μg；
V1――加入三氯甲烷-乙腈混合液溶解残渣的体积，mL；
V2――滴加样液的体积，mL；
n――样液的总稀释倍数；
m――三氯甲烷-乙腈混合液溶解残渣相当样品的质量，g。
参考资料：环境中有毒有害物质与分析检测
