常用毒理学试验方法（五）
发布时间：2017-09-01
二、繁殖试验
繁殖试验是检查受试物对动物繁殖生育功能影响的试验。
(1)试验目的 通过进行繁殖试验，以确定动物摄人受试物后是否仍能正常交配受孕、能否保证胚胎正常发育、分娩过程是否顺利以及后代出生后能否正常发育成长。
生殖系统对外界环境因素的作用非常敏感。外来化学物质可以引起生殖细胞损伤从而影响生殖过程，胚胎、胎儿和新生动物对外来化学物质也常常表现很敏感。
(2)试验动物多用断乳大鼠，也可采用小鼠、家兔等。
(3)剂量分组高剂量组可相当于90天毒性试验中的最大无作用剂量。低剂量组可为高剂量组的若干分之一。同时要设置对照组。
(4)观察指标主要观察以下四个指标，分别反映动物交配受孕、妊娠过程、分娩过程和哺育幼仔成活情况。
如果仔鼠在出生后4天内死亡，则可能由于分娩过程发生障碍，损伤幼仔所致。如在出生后21天内仔鼠死亡，则表示母鼠哺育能力发生障碍。
除上述各项指标外，还可观察仔鼠生长发育情况和一般健康状况，记录进食量、死亡率，并计算饲料效价。饲养3个月后，还可观察性成熟情况。仔鼠出生时和断奶时的体重、身长和尾长可作为生长发育的指标。
三、致畸试验
某些化学物质，可通过妊娠母体干扰正常的胚胎发育而引起胚胎畸形。目前已知与环境有关的致畸物有四氯二苯并二嘿英、敌枯双、五氯酚(钠)、滴滴涕、氯丹、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A等。大量维生素A也有致畸作用。
(1)实验动物常用受孕雌性大鼠、小鼠和家兔等，有条件时也可用狗和猴进行试验。具体试验中最好选用大鼠，因其具有自然畸胎率低、胎仔大小适中便于检查、实用性强等优点。
(2)受试物剂量可根据目的和方法来确定。如果只是定性检查被检物有无致畸作用，组数可少些，每组动物数应较多，剂量应较高。如果试验期间只给予受试物一次，则剂量应较高，多次给予时剂量应较低。一般情况下，高剂量与低剂量之间可适当插入1～3个至4～5个中间剂量组。每组动物数大鼠、小鼠应不少于10～20只。同时还要设置阴性对照组和阳性对照组。阳性对照组动物要给予已知的致畸物，例如敌枯双、五氯酚等。
(3)试验步骤将选定的大鼠或小鼠按雌雄2∶1进行同笼交配，并准确掌握其受精日期。对每只孕鼠应准确记录受精日期、给予被检物日期和剂量。每2～3天称体重一次，并调整剂量，也可对孕鼠及胚胎受被检物影响的程度作出估计。如孕鼠的胚胎发育正常，则孕鼠体重明显持续增长；如果胚胎死亡而被吸收，孕鼠体重将停止增长，甚至下降。鼠类有吞噬畸形初生仔鼠的习性，所以应在预计分娩日期的1～2天(大鼠受孕第19～20天、小鼠受孕第18～19天)，将孕鼠总数的3／4左右处死，检查畸形情况。其余1／4可任其自然分娩，观察仔鼠出生后至断乳前可能出现的畸形及开眼、耳轮张开、出牙和生毛等一般发育情况。
(4)检查项目 胎鼠外观畸形检查、胎鼠内脏畸形检查、胎鼠骨骼畸形检查。
(5)致畸作用结果评定将上述结果按各剂量组进行整理，计算畸胎发生率(畸胎对活胎的百分比)、畸形总数(在所有畸胎上发现的畸形总和)以及某一种显著增多的畸形数目等，并进行统计学处理与分析。自然情况下，各种动物都会有一定的畸形发生率，因此不能根据个别畸形作肯定结论，必须当试验组出现的畸形率显著高于对照组，并且剂量效应(畸形)关系较明显时，才能认为受试物对所用试验动物有致畸性。
致畸性与其他效应一样，动物种别甚至品系间差异很大，因此也不能根据对一种动物具有致畸性就轻率作出对人致畸的结论；必要时可再用其他动物进行试验。在估计受试物质对人体致畸的威胁时，既要考虑人与动物的种间差异，还应充分考虑试验剂量与人体实际可能摄人量之间的差别，后者尤为重要。只要对一种动物具有致畸性就应警惕该受试物可能对人体存在着同样的威胁。目前国际上大量的用大鼠进行的致畸试验纯系出于实用的缘故。
在进行致畸试验时，可根据受试物的性质来选择喂养致畸试验或传统致畸试验。当一种致畸试验的结果已能作出评价时，不要求再做另一种致畸试验。但在结果不足以作出评价时，或有关专家共同评议认为需要时，再进行另一种致畸试验。喂养致畸试验是在动物性成熟时持续给药，观察子1B代(F1B)的畸形情况；传统致畸试验则是交配后在雌性动物孕期给药，并在母鼠分娩前24～48h剖腹检查胎鼠畸形情况。
四、致癌性试验
尽管评价化学物质致癌性的方法较多，但由于致癌物作用的复杂性和各类致突变试验的局限性，要最终确认化学物对哺乳动物的致癌性仍主要依赖长期致癌试验。在此仅就长期动物致癌试验作一简单介绍。
(1)准备工作试验前应掌握受试物的结构一活性关系及其理化性质，建立溶剂相生物材料中受试物(如可能还应包括主要杂质)的定性、定量分析方法并确定受试物的成分及主要杂质。
(2)实验动物 对活性不明确的化学物建议使用两种动物进行试验。啮齿动物应优先选择大鼠和小鼠，因为它们的生命期相对较短，饲养成本低，对诱发肿瘤较敏感，较易获得纯系，研究者容易掌握其特性。在选择品系时应充分了解实验动物的特异敏感性。应使用两种性别、刚断奶不久的年幼动物，以便可在其大部分生命期中观察肿瘤的发生，且保证观察期与染毒期一致。
(3)动物数量应保证在试验结束时，每个剂量组和相应的对照组至少有雌、雄各50只。若计划在试验过程中处死一些动物，则应在试验开始时将此数量考虑进去。
(4)染毒剂量一般至少设三个剂量组和相应的对照组。最高剂量应足以引起最低毒性表现，但又不致产生由非肿瘤因素造成的正常生命期限的明显改变。毒性征象可表现为酶水平的改变或体重增长受到轻度抑制(降低应低于10 %)。如与饲料混合在一起，则最高浓度不应超过5％，但受试的营养素不受此限。最低剂量应不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不能引起任何毒性表现。
(5)染毒方法可采用经口、经皮和吸入三种染毒方式。染毒途径的选择取决于受试物的理化特性和人的主要接触方式，还需考虑技术上的可行性。只要能证明受试物可经胃肠道吸收即应首选经口染毒。
(6)试验期限按下述原则确定试验期限。①一般情况下，小鼠和仓鼠在18个月、大鼠在第24个月结束试验。对于寿命较长或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可在第24个月、大鼠在第30个月结束试验。②当较低剂量组或对照组的存活动物数达25％时可以结束试验。对于有明显性别差异的试验，可考虑分性别处理，不同性别动物可在不同时间结束试验。如仅高剂量动物因明显的毒性作用过早死亡时，不应结束试验。
合格阴性对照组的基本判别标准是：①任何组因组织自溶、自食或管理问题造成的动物损害不超过10％；②小鼠和仓鼠试验第18个月、大鼠的第24个月各组动物存活率不能少于50％。
对一种动物有明确的致癌作用，即可认为该受试物对人类有潜在的致癌危险；但只有在至少用两种动物都得到阴性结果时，才能将该物质对人的潜在致癌作用判为阴性。
参考资料：环境中有毒有害物质与分析检测
