常用毒理学试验方法（四）
发布时间：2017-09-01
所用的肝微粒体由大鼠肝脏制备。大鼠生前先用多氯联苯进行肝微粒体酶诱导，然后取肝匀浆9000g上清液部分，使用时再加入微粒体酶催化作用时所需要的辅助因子，即辅酶Ⅱ与6-磷酸葡萄糖，此种混合物简称S-9混合液。
试验时，将受试物、指示微生物与S-9混合液在琼脂平皿上培养，由于所用基本培养基不能满足组氨酸缺陷型微生物的生长需要，故不能生长。但如受试物具有致突变作用，则可使组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌发生回复突变，成为野生型，恢复了合成组氨酸的能力，故可能在组氨酸含量不足的基本培养基上生长成菌落。而对照组的平皿上未加受试物，基本培养基上仅有少数自然突变菌落。据此可以确定受试物是否具有致突变作用。试验组平皿上菌落数为对照组平皿上的自然突变菌落数2倍以上者则为阳性结果。
2、微核试验与骨髓细胞染色体畸变分析试验
在毒理学试验中，微核试验与骨髓细胞染色体畸变分析试验可任选一种进行检测。
(1)微核试验是根据在间期细胞质内出现的一种圆形或椭圆形的小体，判断化学物质诱发染色体异常作用的一种简便的体内试验方法。
微核出现是一种染色体异常现象。当某种化学物质导致骨髓细胞染色体发生突变时，则染色体在细胞分裂中期就会断裂，部分断片在有丝分裂后期滞留在赤道板附近。在有丝分裂终期不进入子细胞核，而存留在间期细胞内，形成一个或几个圆形至杏仁状结构，并存留一定时间，称微核。典型的微核呈圆形，直径相当于红细胞直径的1/20～1/5，染色与核质相同。微核出现率与染色体畸变之间有明显相关性，故能反映染色体畸变情况。
基本试验程序是在小鼠或其他啮齿动物接触受试物约24～30h后取骨髓或血液淋巴细胞，对骨髓有核细胞或多染色性红细胞，或有核红细胞，或淋巴细胞，制备标本并染色，计算有微核的细胞数。外周淋巴细胞也可用于检测细胞体外接触化学物质的微核数。
(2)骨髓细胞染色体畸变分析试验 是在体细胞或生殖细胞内，直接观察在化学致突变物作用下，生物细胞染色体所发生的结构或数目的改变。一般多以骨髓细胞或外周血细胞代表体细胞，以睾丸精原细胞代表生殖细胞。染色体的数目和形态在有丝分裂中期最易观察，故染色体畸变分析多在有丝分裂中期细胞进行。
微核试验动物常用出生后8～15周左右的大鼠或小鼠。给予受试化学物质的次数急性试验为一次；亚急性为每天一次，共5～7天；慢性试验每天一次，可达3个月。剂量分组可以最大无作用剂量或人体实际摄人量的100倍为高剂量组，以人体实际摄入量为低剂量组，可设中间剂量组。除阴性对照组外，还可用一已知致突变物为阳性对照组。试验结束后处死动物，在取出骨髓前2～5h应注射秋水仙碱，使细胞有丝分裂停留在中期，以便观察。取出骨髓后用低渗氯化钾溶液进行低渗处理，然后固定、制片、染色，最后观察畸变情况。
3、显性致死试验、睾丸生殖细胞染色体畸变分析试验和精子畸形试验具体应用时，可任选其中一项进行试验。
(1)显性致死试验是通过哺乳动物生殖细胞染色体畸变进行的致突变试验。所谓显性致死或显性致死突变，是由于双亲中某一方面的配子(精子或卵子)的染色体畸变，从而使受精卵在发育中途中断，易造成受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡。
试验多用雄性大鼠或小鼠进行。动物接触(经口)受试物的时间可为一次、5～7天或3个月。然后将雄性与雌性动物按一雄二雌比例交配，雌性动物不接触受试化学物质。雌鼠受孕后12～13h剖腹取出子宫，检查并记录活胎数、早期死亡胚胎数、晚期死亡胚胎数，并计算总着床数(可按早期与晚期死亡胚胎数和活胎数计算)。早期胚胎死亡数可反映受试化学物质致突变作用的强弱。以受孕雌性动物数为基础，计算每一受孕雌性动物早期死亡胚胎数，并以此表示致突变作用强弱。
显性致死突变试验的特点是哺乳动物以早期胚胎死亡数为观察指标，简单明确。但不如Ames法灵敏，且只能反映雄性生殖细胞染色体畸变，不能检出基因突变。
(2)睾丸生殖细胞染色体畸变分析试验其原理和基本方法与骨髓细胞染色体畸变分析相同。实验结束后取出动物睾丸，用低渗氯化钾溶液处理后，固定、制片、染色，观察精原细胞染色体畸变情况。
(3)精子畸形试验受试化学物质如能影响实验动物的精子成熟过程，则可观察到精子头部或尾部的形态学变化。
4、DNA修复合成试验
化学致癌物对DNA可产生各种形式的损伤，如碱基损伤、链断裂、交联和嵌入等。DNA受损后，在各种修复酶参与下，通过切除修复或复制后修复两种方法进行修补。修复机制能够使生物体保持相对稳定的遗传学特征。
DNA损伤及其修复之所以可作为化学物质致癌性筛选，是因为已经证明多数化学致癌物(有的需经代谢活化)可与细胞大分子物质(DNA、RNA及蛋白质)的亲核基团发生相互作用，并可诱发各种类型的DNA损伤，后者可能是致癌过程的一个启动步骤。
DNA修复有多种类型，当前只有切除修复的检测被用于致癌物的筛选。切除修复的全过程大致分为以下几个步骤：首先由各种有关的核酸内切酶识别DNA链中的损伤部位，并在损伤部位的5’端将DNA链切开；然后由核酸外切酶从损伤区的5’端切除一段包括损伤区在内的核苷酸链，同时以完好的互补链为模板，由DNA聚合酶以5’→3’方向合成一段相应长度的DNA片段填补在此空隙中；最后由连接酶将合成的小段DNA链与DNA断链重新连接起来，完成修复过程。切除修复的各个过程可由一定方法予以检测。DNA损伤区的切开和以后的连接、一些致癌物直接引起的链断裂及其修复，可在化学物质接触后的不同时期进行测定。用碱性蔗糖梯度离心法或碱性洗脱法检查DNA单链分子量，能了解到单链断裂的情况；检验损伤区的切除，可用经化学物质处理后不同时期所提取的DNA观察其碱基损伤情况、内切酶敏感部位的消长以及用同位素标记法测知细胞：DNA中与标记化合物结合的放射性强度的变化。
值得重视的是程序外DNA修复合成，在正常情况下DNA合成只出现在细胞周期中的S期，但当DNA受到损伤时，其修复合成在损伤后的任何时期内均可随即出现。可用于测试的细胞有多种(体细胞和生殖细胞均可用)，但一般按其活化系统分为两类：一类细胞本身无活化系统，常用的有人类二倍体成纤维母细胞；另一类是具有活化系统的大鼠肝细胞。
当前，在DNA修复合成试验中，可预测化学物质致癌性的测试方法，应首选程序外DNA测定。该测定系统可使用人或啮齿动物细胞进行体外试验，也可进行体内试验。一般而言，在体外试验中人细胞较啮齿动物细胞敏感。
致突变试验可根据受试物的化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点的不同，并兼顾体外和体内试验以及体细胞和生殖细胞的原则，在以上四类中选择三项试验。
(三)结果判定
①如果其中三项试验均为阳性，则无论蓄积毒性如何，均表示受试物很可能具有致癌作用，除非受试物具有十分重要的价值，一般应予以放弃。
②如果其中两项为阳性，而又有强蓄积性，则应予以放弃；如为弱蓄积性，则由有关专家进行评议，根据受试物的重要性和可能摄入量等，综合权衡利弊后再作出决定。
③如果其中一项试验为阳性，则再选择两项其他致突变试验(包括体外培养淋巴细胞染色体畸变分析、果蝇隐性致死试验、DNA合成抑制试验和姐妹染色单体互换试验等)，如果此两项均为阳性，则无论蓄积毒性如何均应予以放弃；如有一项阳性，且为强蓄积性，则予以放弃；如有一项为阳性，且为弱蓄积性，则可进入第三阶段试验。
④如果其中四项试验均为阴性，则无论蓄积性如何，均可进入第三阶段试验。
参考资料：环境中有毒有害物质与分析检测
