常用毒理学试验方法（三）
发布时间：2017-09-01
5、观察指标
除了血、尿常规，肝、肾功能及病理组织学检查应列为常规检查外。还应根据受试物的毒作用特点，选用其他最敏感的指标。
(1)一般性指标如动物体重增长率、食物消耗率、活动能力等，这些指标的变化是实验动物对化学物毒性的整体反应。体重明显下降常常是中毒或疾病的信号，也是一项比较敏感的毒性反应指标。
(2)特异性指标用以测定化学物作用于机体后所引起的特异性反应，也有助于取得中毒机理的线索。它能更确切地阐明受试物对动物产生有害影响的阈剂量(浓度)及无作用剂量(浓度)。试验设计时，应尽量选用特异性指标。比如用有机磷农药染毒时可测定血中胆碱酯酶活性；芳香族硝基化学物染毒可测定高铁血红蛋白；无机氟染毒可检查斑釉发生率及牙齿和骨氟含量。
(3)一般化验指标主要检查血常规和肝、肾功能。通常血常规检查的项目有红细胞计数、白细胞计数和分类、血红蛋白定量等。另外，还应根据化学物毒作用特点进行特殊项目的检查。如铅中毒时检查点彩红细胞，必要时可检查骨髓细胞成分。肝功能检查常用的有谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(COT)、碱性磷酸酶(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)及其同功酶等活性测定。肾功能检查可进行尿谷草转氨酶含量测定、血清尿素氮测定、尿蛋白定性或定量、尿沉渣检查等。
(4)有害物质的代谢动力学指标为了明确汞、镉、铅、砷、氟等有害物质在体内的分布及排泄情况，为流行病学调查提供诊断依据，常常需要对血、尿、毛发等生物材料中相应有害物质的含量进行测定。也可以测定化学物的代谢产物，如氰化物和有机腈化物经代谢后，大部分以硫氰酸盐的形式从尿中排出。
(5)病理组织学检查凡是在染毒过程中死亡的动物均应及时解剖，以排除其他致死原因。肉眼检查后再进行病理组织学检查，必要时进行组织化学或电镜检查。病理组织学检查应特别注意靶器官的变化，但肝、肾等组织应列为常规检查项目，同时应对所见的病变程度作出定量分类，以便统计分析。脏器系数常常是一项比较灵敏的毒理学指标。
脏器系数=内脏质量(g)／体重(g)
脏器系数常能反映中毒引起的病变情况。脏器系数减小，表示脏器发生萎缩、退行性变化；脏器系数增大，则可能是充血、水肿、增生肥大性变化等。
四、慢性毒性试验
慢性毒性试验是在实验动物生命周期中的关键时期，用适当的方法和剂量给动物染毒后，观察其累计的毒性效应，有时可包括几代的试验。主要目的是评价化学物在长期小剂量作用的条件下对机体产生的损害及其特点，确定慢性毒性作用阈剂量和最大无作用剂量，为制定环境中有害物质的最高容许浓度(MAC)提供依据。
1、实验动物
常选用初断乳的大鼠和小鼠或家兔和狗。大鼠应选择出生后3～4周，体重50～70g者；小鼠应选择出生后3周，体重10～12g者。每组染毒动物的数量目前还元统一看法，可根据具体实验及统计学分析的要求确定，一般大鼠每组20～40只，家兔6～10只，狗4～6只，每组实验动物雌雄各半。
2、染毒期限
染毒期限一般要求1年以上或2年。也有学者主张动物采用终生染毒，认为终生染毒所求得的阈剂量与无作用剂量更能全面反映外源化学物的慢性毒性作用。但有人分析了一些毒理学实验资料后认为：毒物所致的病理改变大部分在6个月以内出现，以后所增加的病理变化为数甚少。所以一般毒性试验不需把染毒期限定得太长。大鼠、家兔一般为6个月，狗6～12个月。但对一些有明显蓄积作用的化学物，或拟采用慢性毒性与致癌性联合试验，则应适当延长试验期限，大鼠应进行2年。目前在进行环境毒理学研究时，其他一些国家推荐用90天试验代替慢性毒性试验。
3、剂量分组
原则与亚慢性试验相同，一般设3～4个剂量组和一个对照组，必要时再加一个受试物的溶剂对照组。因染毒时间长，确定剂量时应十分慎重，可根据亚慢性试验资料，取其最低引起中毒反应剂量的1/10、1/20及1/50或LD50的1/1000、1/lOO、1/lO作为慢性实验的剂量。最大剂量组实验动物应有轻微可见的毒性反应或某些化验指标明确而轻微的改变；最低剂量组应是阈剂量组或无作用剂量组，根据实验目的确定。
4、染毒方式和观察指标的选择
原则同亚慢性毒性试验，尽量选择在亚慢性试验中找到的特异性和敏感性指标。
遗传毒理学试验的首要目的是确定被检化学物质诱导供试生物发生突变的可能性。以致突变试验来定性表明受试物是否具有致突变作用或潜在的致癌作用。遗传毒理学试验的组合必须考虑原核细胞和真核细胞、生殖细胞和体细胞、体内与体外试验相结合的原则。到目前为止，遗传毒理学已发展_出上百种试验系统，在此仅就几种常见的试验方法作一简要介绍。
(一)目的
致突变试验的目的是对受试物是否具有致癌作用的可能性进行筛选。
致突变试验是遗传毒理学的主要内容。近年来愈来愈多的结果说明，致癌剂往往就是致突变物质，而致突变物质也往往具有致癌作用。两者的相关是十分密切的，当然也有已知致癌剂却不具有致突变作用，这可能与其他不涉及DNA的致癌机制有关。
致突变试验是检验外来化学物质有无引起突变作用的试验。突变是生物细胞的遗传物质出现了可被觉察并可以遗传的变化。能引起生物细胞发生突变的物质称为致突变物。突变可以分为基因突变和染色体畸变。基因突变是指染色体上一个基因或几个基因发生变化，不能用光学显微镜直接观察到，需要用其他理化或生物学方法才能检出。染色体畸变是指整个染色体结构或数目发生了变化，用光学显微镜可以直接观察到。
突变可通过生殖细胞传给后代，引起遗传性疾病，也可通过体细胞在接触诱变物的个体上表现出来，通常认为这可能是癌症的原因。在毒理学试验中，如果受试物可引起人或动物基因突变或染色体畸变，则应该禁止应用于食品中。
(二)试验项目
致突变试验的基本原理是将受试物与一种生物系统相接触，然后观察该生物系统是否发生突变。凡能使生物系统发生突变者，即为致突变物。致突变试验中所用的生物系统包括细菌、真菌、昆虫、细胞株和哺乳动物等。
1、Ames试验
Ames试验即微粒体间接法，亦称为鼠伤寒沙门菌／哺乳动物微粒体酶试验法。
Ames法基本原理是以一种突变型微生物与受试化学物质接触，并以哺乳动物肝微粒体进行受试化学物质的代谢活化，因为外来化学物质在哺乳动物体内的生物转化主要是由肝微粒体的混合功能氧化酶来进行。若受试物经多功能氧化酶代谢活化后具有致突变性，则可使突变型微生物发生回复突变而重新成为野生型微生物。
突变型微生物的来源是将野生型微生物用物理或化学方法使其发生突变，成为突变型。Ames试验所用指示微生物为组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌的几个特殊菌株，即TAl535、TAl536、TAl537、TAl538、TA98和TAl00。这一组突变菌株几乎可以检出所有已知的基因突变类型。
参考资料：环境中有毒有害物质与分析检测
