常用毒理学试验方法（二）
发布时间：2017-09-01
(二)急性非致死毒性试验
急性非致死毒性试验可用来测定常见的非致死毒性的安全界限，也可为急性中毒的危险性评估提供依据。一些测定受试物刺激作用的方法如下。
1、急性阈剂量(浓度)的测定
可根据受试物对机体作用的性质、实验目的和具体条件，选择合适的、灵敏的观察指标。例如对于刺激性气体，可测定其刺激阈浓度或感官阈浓度。实验动物多选用健康猫数只，置于含有受试物的染毒柜内，染毒30min。观察并测得刚引起30 %动物出现轻微刺激症状(流泪、流涕、流涎等)的浓度作为阈浓度。
2、局部刺激试验
许多化学物可引起接触的皮肤和黏膜损伤，常采用皮肤和眼结膜刺激试验来评定其毒性作用。
(1)急性皮肤刺激试验选用健康成年家兔或豚鼠，不少于4只。按皮肤染毒法去毛，取受试物0.1mL或0.5mL(固态受试物用水或赋形剂调制)，涂于一侧皮肤上，另一侧涂赋形剂作对照，敷用lh或24h。去除受试物后lh、24h、48h和72h观察涂抹部位反应，按皮肤刺激反应积分评定刺激强度。
(2)急性眼刺激试验将液态或软膏受试物(O.1mL或100mg)滴入或涂入实验动物一侧结膜囊内，另一侧眼作为对照。于6h、24h、48h和72h后观察局部反应，第4天、第7天观察恢复情况，观察时可用荧光素钠检查角膜损害。评定标准可参考我国《化妆品安全性评价程序和方法》及有关资料。
二、蓄积性和耐受性试验
蓄积作用是环境化学物慢性中毒的基础。大多数外来化学物质进入机体后，经过复杂的生物转化和生物转运过程，最后将由体内消除。如果一种外来化学物质反复多次进人机体而
且其前次进入剂量尚未完全消除，后一次剂量又已经进入，则这一化学物质在体内的总量将不断增加，此种性质称为蓄积性。将一种有毒化学物质以较小剂量按一定时间间隔反复多次输入体内，如果此种有毒物质每次在体内可以蓄积一定数量，当蓄积的总量超过其中毒阈剂量时，机体可呈现毒性反应或死亡。
化学物质在体内的蓄积包括两层含义，当化学物质进入机体后，在体内消除的数量少于输入的数量，以致其在体内储留的量逐渐增加，此种量的蓄积也可理解为物质的蓄积。另一层含义是化学物质进入机体后将引起机体的功能或结构形态发生一定程度的改变，如果是一种不可逆的变化，或在机体修复过程尚未完成前，化学物质第二次又已进入机体，并再次造成损害，则这种功能或形态变化也可逐渐积累，也就是功能蓄积。
(一)蓄积性试验
环境化学物蓄积性试验可采用蓄积系数法或20天试验法进行。
1、蓄积系数法
将某种化学物质按一定时间间隔，分次给予动物，经过一定期间的反复多次给予后，如果该物质全部在体内蓄积，则多次给予的总剂量与一次给予同等剂量的毒性相当；反之，如该化学物质在体内仅有一部分蓄积，则分次给予总量的毒性作用与一次给予同等剂量的毒性作用将有一定程度的差别，而且蓄积性越小，相差程度越大。因此，可将能够达到同一效应(LD50)分次给予所需的总剂量[以LD50(n)表示]与一次给予所需的剂量之比，来表示一种化学物质蓄积性的大小，即K=LD50(n)，／LD50(1)。
K值越大，蓄积性越弱；反之，K值越小，蓄积性越强。一般可根据K值对蓄积性进行估计：1≤K＜3表示强蓄积；3≤K＜5表示中等蓄积；K≥5表示轻度蓄积。
2、二十天试验法
给药共20天，试验动物可采用成年大鼠(体重200g左右)，每组10只，要求雌雄分别同时进行，共5组。各组受试物剂量分别为LD50的1/20、1/10、1/5、1/2，另设对照组。每天灌胃一次，连续20天。各组累积总剂量可达1LD50、2LD50、4LD50、10LD50，观察7天。
如蓄积系数K小于3，为强蓄积性；K大于或等于3，为弱蓄积性。20天试验法如1／20LD50组动物有死亡，且有剂量一效应关系，则为强蓄积性；如1／20 LD50组动物无死亡，则为弱蓄积性。强蓄积性者放弃。
(二)耐受性试验
耐受性是机体多次接触化学物质后，对该物质产生反应性减弱的现象，显示不易发生慢性中毒。对动物耐受性的观察多在蓄积性试验结束后，如果剂量已远超过5个LD50，死亡动物未超过半数，说明该物质蓄积性很低外，也可能机体已产生耐受性。为此，可对尚存活的动物给予一个LD50的打击剂量，并观察动物死亡情况，如死亡率明显低于对照组，表示已产生耐受性。
三、亚急性和亚慢性毒性试验
亚急性和亚慢性毒性试验是指实验动物连续多日接触较大剂量(小于急性LD50的剂量)的外来化学物所出现的中毒效应。染毒期一般为1～6个月，有的研究者采用更短的时间，2周至一个月，称为亚急性试验，染毒3～6个月的称亚慢性试验。亚急性或亚慢性试验的目的是在急性试验的基础上，在较短时间内了解受试物对机体的主要毒性作用及其靶器官，探讨敏感的观测指标和剂量一效应关系，为慢性毒性试验提供依据。
1、实验动物
所用实验动物应是急性毒性试验已经证明对受试物敏感的种类和品系。常选用两种以上的动物，所选用的动物对受试物的生物转化方式与人基本相同。一般首选大鼠，每组10～20只，兔、狗等较大动物，每组不应少于4只，雌雄各半。
2、实验期限
亚急性和亚慢性毒性试验的期限至今尚无完全统一的认识。制定时应根据实验目的和动物种类而定，一般为实验动物寿命的10％左右。有的学者主张进行慢性毒性试验时，将受试物混合于饲料或饮水中，动物自由摄取连续90天。也主张呼吸接触可进行30天或90天试验，每天6h，每周5天。经皮肤接触进行30天试验。在测试期内，要求每天的染毒剂量相等。
3、剂量分组
在亚急性或亚慢性试验设计中，染毒剂量选择是否恰当是试验成败的关键。一般设3～4个实验组和一个对照组。最高剂量可选用1／20～I／5LD50。对于在体内不产生蓄积作用而排泄又快的物质可适当加大剂量，反之则可减少剂量。一般要求在实验结束时，最低剂量组的动物不会产生可观察到的毒性反应，相当于亚慢性的最大无作用剂量；中间剂量组应产生轻微的毒性反应，相当于亚慢性毒性的阈剂量；最高剂量组要求能引起动物明显的毒性反应，但又不引起动物死亡。相邻组距可根据死亡剂量一效应曲线和蓄积系数，选择3～10倍的比例。蓄积性强的化学物，组距要大些，反之要小。
4、染毒途径
染毒途径的选择既要与人类实际接触的途径或方式尽可能一致，又要与预期进行的慢性毒性试验的接触途径相一致。对气体和挥发性物质可采用呼吸道吸入染毒。农药、重金属及各种能污染水和食物的化学物，应采用经口染毒，可采用喂饲法或灌胃法，也可将化学物混入水中，让动物自由饮用。对于有气味、挥发性或刺激性的物质应采用灌胃法。试验期间，每天应定时染毒，以维持试验动物血液(体液)中受试物浓度稳定，以保持每天相似的毒性效应。
参考资料：环境中有毒有害物质与分析检测
