常用毒理学试验方法（一）
发布时间：2017-09-01
应用毒理学试验方法评价外来化学物的毒性时，最常用的是哺乳动物体内试验，包括急性、蓄积性、亚急性、亚慢性和慢性毒性试验。对一些特殊毒物，常常还需要进行致畸、致突变和致癌性研究。再根据动物实验结果外推到人，以便正确评价该化学性毒物对人体可能表现的毒性危害，为制定合理科学的环境卫生标准提供依据。
慢性毒性试验在环境毒理学研究中占有重要地位，对评定环境化学污染物对机体的慢性危害具有重要意义。同时慢性毒性试验结果也是制定环境中有毒有害物质卫生标准的重要依据。急性、亚急性和亚慢性试验是慢性试验的基础，能为慢性试验的开展提供重要资料。
值得注意的是，动物试验有一定的局限性。首先，实验动物存在着种属、品系、年龄等差异，表现在对受试物的敏感性方面也有差异；其次，人和动物在寿命及生物学反应性等方面存在着差异；再次，所用实验动物不能获得对毒物感觉反应(色、嗅、味等)方面的资料。因此，在应用动物实验结果外推到人时，仍存在一定误差，如果能结合流行病学资料进行分析，将会得出更加准确的研究结果。
一、急性毒性试验
急性毒性试验是指一次大剂量染毒或24h内多次染毒对动物产生的毒性作用。其目的是在短期内了解受试物的毒性大小和特点，并为其他毒性试验的开展提供资料。急性毒性试验可分为急性致死毒性试验和急性非致死毒性试验。
(一)急性致死毒性试验
由于各种毒物对动物最严重的毒性作用结果是死亡，因此一般把死亡作为评价急性毒性的常用指标。划分毒性大小的依据是致死剂量(LD)或致死浓度(LC)。可按照引起动物不同死亡率所需的剂量来表示，如绝对致死量(LD100)、半数致死量(LD50)、最小致死量(LD0)等，其中 LD50是衡量毒物急性毒性大小的基本数据，是表示急性毒性大小最常用的指标，可以用它的倒数对试验条件类似的许多化学物质的毒性强弱进行比较。与其他致死量相比，LD50对受试物的个体感受性影响较小，有更高的重现性，结果较稳定；它处于剂量一效应曲线的中段，是死亡率对剂量最敏感的部位，有60％～70 %死亡动物集中在LD50附近，因此最具代表性。但LD50只表示一种物质的急性毒性，并不说明该物质其他方面的毒性。
LD50是一个统计学估计数值，存在一定的抽样误差和可信限，有较大的变异范围。如用不同实验动物，给予受试物的途径不同，其变动幅度更大，因而以LD50(LC50)表示毒性大小时需要注明，如DDT LD50250mg／kg(大鼠、经口)，二硫化碳LC5028.38mg／m3(小鼠、吸入2h)。
1、实验动物
对实验动物品系的要求是：受试物在体内代谢情况与人体接近；对受试物最敏感。一般采用初成年的啮齿类，大鼠为首选动物。其特点是来源广、经济、便于管理，毒性资料较多，便于比较。若不足以反映毒性大小和特点时，可考虑选用一种非啮齿动物如狗。因实验动物对毒物的敏感性存在差异，因此应选用两种性别、成年和幼年动物进行测定。
2、染毒途径与方式
一般应与人的接触途径相同，常用的有以下几种。
(1)经口染毒常采用灌胃法，或将受试物放在饮水中由动物自由摄取。
用于溶解或配制受试物的溶剂本身应该无毒，且不与受试物起反应。灌胃容积一般大鼠≤3mL，小鼠≤0.5mL，当染毒剂量过大时，可分几次给药。
(2)经呼吸道染毒将实验动物放在有毒气或粉尘的染毒柜内进行染毒。急性吸入染毒可采用20～25L静式染毒瓶或25～50L染毒柜，加入一定量受试物使其形成所需浓度的空气环境，让动物自由吸入，染毒时间一般2～4h。
(3)经皮肤染毒对化妆品、农药等化学物质常采用皮肤染毒进行急性毒性试验。常用动物是成年家兔或豚鼠，有时也用大鼠和小鼠。在正式给药前24h，给动物背部脱毛。将受试物均匀涂布于皮肤表面，用纱布覆盖，连续涂敷24h。采用兔耳法染毒时，应将一只耳作为对照，另一只耳涂布受试物，逐日观察耳部的颜色、水肿等变化过程。
局部作用还可用兔结膜囊做实验，一侧眼结膜滴加受试物，另一侧作对照，观察受试物能否引起眼结膜发红、水肿、畏光，有无分泌物及其他变化等，并作适当评价。
(4)注射途径染毒 常用于比较受试物毒性以及受试物的代谢、毒理动力学等研究。可采用静脉(如大鼠、小鼠尾静脉，兔耳缘静脉等)、肌肉、皮下、腹腔等途径注射。
3、受试物剂量及动物分组
首先应根据受试物的理化性质、化学结构以及资料中类似化学物的致死量进行估计，再以估计的LD50(或LC50)值作为受试物的预期毒性中值，以此中值作为受试物的中间剂量组，再上下各推1---2个剂量组进行预试，以找出粗略的LD50及LD0。正式试验可在LD100与LDo之间设5～7个剂量组，组间距以1.2～1.5倍为宜。动物数为小鼠每组10只，大鼠6～8只，使用兔或狗等大动物时每组应不少于4只。每组动物应雌雄各半。
4、观察时间及内容
染毒后要检查动物死亡数和死亡时间，并观察神经、呼吸等系统的中毒表现。不同受试物引起动物死亡的时间不同，有的甚至在染毒后几分钟内即可出现死亡，而有的在染毒2～3天后才出现明显的中毒症状，通常需要连续观察7～14天，以免迟发反应被遗漏。
试验结束后，要对死亡与存活动物作大体解剖。存活24h以上的动物，肉眼观察到的病变组织、器官需进一步作病理学检查。
5、LD50的测定与结果评价
测定LD50及其标准误差的方法很多，可采用寇氏法和霍恩氏法等。寇氏法计算较准确，应用也较广泛。测定时要求各组实验动物数目相等，最小剂量死亡率为0或近于0，最大剂量死亡率为100％或近于100％。
霍恩氏法又称流动平均法或剂量递增法，所需动物少，计算简便，但结果误差大，适用于预试验。此外，几率单位法也是最常用的测定方法之一。
根据所得结果，按下表急性毒性分级标准，评定其毒性本小。LD50值愈小，表示受试物的毒性愈大；反之则越小。一些化学性毒物的毒性分级标准见表2-1和表2-2。
参考资料：环境中有毒有害物质与分析检测
