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高效液相色谱法-果汁(苹果汁)中有机酸的分析
发布时间：2017-09-01
1、实验目的
(1)了解HPLC在食品中的应用。
(2)理解缓冲溶液在流动相中的作用。
(3)掌握用内标法对组分进行定量分析的方法。
2、实验原理
在食品中，主要的有机酸是乙酸、丁二酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸等，它们可能来自原料、发酵过程或是添加剂。这些有机酸在水溶液中有较大的解离度。在反相键合相色谱中易发生色谱峰拖尾现象。苹果汁中的有机酸主要是苹果酸和柠檬酸。在酸性流动相条件下(如pH 2～5)，上述有机酸的离解得到抑制，利用分子状态的有机酸的疏水性，使其在C18键合相色谱柱中能够保留。由于不同有机酸的疏水性不同，疏水性大的有机酸在固定相中保留强，较晚流出色谱柱，否则较早流出，从而使各组分得到分离。
内标法是色谱定量中常用的方法，该法适用于只需对样品中某几个组分进行定量的情况，定量比较准确，对进样量和操作条件的稳定性要求不太苛刻。本实验选择酒石酸为内标物，只对苹果汁中的苹果酸和柠檬酸进行定量分析。
有机酸在波长210nm附近有较强的吸收，因此可采用紫外检测器进行检测。
3、仪器与试剂
仪器：高效液相色谱仪、紫外检测器、脱气装置。
试剂：磷酸二氢铵(优级纯)：配制8mmol／L的水溶液和2mmol／L水溶液；重蒸去离子水；
苹果酸(优级纯)：准确称取一定量的苹果酸，用重蒸水配制1000mg／L的溶液，使用时适当稀释；
柠檬酸、酒石酸皆为优级纯，配制水溶液(方法同苹果酸)；
3种有机酸的混合标准溶液：各含约200mg／L；
苹果汁：市售苹果汁用0.45μm滤膜过滤后备用。
4、实验内容与步骤
(1)参照仪器使用说明开机，排空流路中的气泡。
(2)设置实验参数：C18键和相色谱柱，流动相为0.8mmol／L和0.2mmol／L的磷酸二氢氨水溶液，比例为1／1(体积比)，流速为1.0mL／min，柱温为30℃，紫外检测波长为210nm，进样量20μL。
(3)启动色谱系统，待基线稳定后，注入3种有机酸的混合标样，观察分离情况。
(4)调整流动相的比例，使3种有机酸得到良好的分离。
(5)分别注入3种有机酸的标样，根据保留值进行定性。
(6)注入有机酸混合标样，重复3次(峰面积误差小于3％)，用于计算各自的校正因子。
(7)注入待测苹果汁的样品，重复3次(峰面积误差在3％之内)。
(8)准确称量一定量的内标物酒石酸样品，加入到准确称量的待测苹果汁样品中，记录各自的称量值，摇匀待用。
(9)注入含有内标物的待测苹果汁样品，重复3次(峰面积误差在3％之内)。
(10)按关机程序关机。
5、注意事项
(1)配制样品时，称量一定要准确。
(2)实验结束后以纯水为流动相，冲洗色谱柱，以避免柱的堵塞。
6、数据处理
(1)计算3种有机酸的校正因子和分离度。
(2)按外标法计算苹果汁中苹果酸和柠檬酸的含量。
(3)以酒石酸为内标物，按内标法计算苹果汁中苹果酸和柠檬酸的含量，与 (2)的结果进行比较，并加以讨论。
参考资料：现代仪器分析实验与技术
