高效液相色谱法实验
发布时间：2017-09-01
一、VE异构体在正相HPLC系统中分析条件的选择
1、实验目的
(1)了解HPLC仪器的基本结构和工作原理，学习仪器的基本操作。
(2)理解正相HPLC的特点和应用。
(3)学习选择正相HPLC最佳分析条件的方法。
2、实验原理
维生素E(VE)为苯丙二氢吡喃醇衍生物，因其在苯环上有一个酚羟基，故此类化合物又称生育酚。VE主要有a，β，γ和δ4种异构体，其中以α-异构体的生理作用为最强，而抗氧化能力则以δ-异构体为最强。通常所说的VE是一个多种异构体混合物，有时可能以生育酚羧酸酯的形式存在。
正相HPLC通常也称液一固色谱，它是以极性固体吸附剂为固定相，以弱极性或非极性溶剂为流动相组成的色谱体系，该体系中被分离的各组分在固定相表面的活性中心发生竞争吸附，由于吸附能力的不同，被流动相洗脱的速度不同，得到彼此的分离。另外，若组分分子构型与吸附剂表面活性中心的几何构型相适应，则作用力较强者易被吸附，因此液一固色谱常用于分离各种类型的异构体。
分离效能与诸多因素有关，如吸附剂种类、比表面积、物化性质、组分分子的结构、流动相的性质与组成等。本实验重点是流动相的选择。
3、仪器与试剂
仪器：高效液相色谱仪：带紫外检测器；
超声波发生器：用于样品溶解，流动相脱气，玻璃器皿清洗。
试剂：异丙醇、正己烷、无水乙醇(纯度均为AR)；
混合维生素E：用50mL的烧杯称取混合VE100～150mg，用无水乙醇溶解并定容至25mI。容量瓶，使用时用无水乙醇稀释5～10倍；
α-VE标准溶液：准确称量α-VE标样，用无水乙醇配制，浓度约1000mg／L，使用时用无水乙醇或流动相溶液稀释5～10倍。
4、实验内容与步骤
(1)按仪器操作说明书规定的顺序依次打开仪器各单元的电源。
(2)检查色谱柱和流动相：本实验采用硅胶柱(Micropak Si-5Ø4.6mm i.d.×150mm)，流动相为正己烷和异丙醇。
(3)设置1 00％正己烷为流动相，流速为1.0mL／min，色谱柱温度为30℃，检测波长为292nm(可经紫外-可见光光谱仪扫描确定)。
(4)检查或排除流路中的气泡，启动输液泵。
(5)待基线稳定后用六通阀注进混合VE样品(注射器和六通阀用溶剂和样品溶液冲洗数次，并注意不要吸入气泡)。
(6)观察VE异构体分离情况，记录保留时间和半峰宽。
(7)将流动相换成正己烷／异丙醇混合溶剂(体积比99.5/O.5)，待基线稳定后，注进混合VE样品，重复(6)的操作。
(8)将流动相换成正己烷/异丙醇混合溶剂(体积比98/2)，待基线稳定后，注进混合VE样品，重复(6)的操作。
(9)比较(7)和(8)，找出最佳色谱条件，注入α-VE标样，确认混合VE样品中α-VE峰的位置。
(10)所有样品分析完后，让流动相继续流动10～20min，然后停泵，关机并整理好实验台。
5、注意事项
(1)操作时一定要参照仪器的操作规程。
(2)开泵前应检查流路中的气泡，应确保排除干净。
(3)色谱柱的个体差异很大，因此，色谱条件(主要是流动相配比)应根据所用色谱柱的实际情况作适当的调整。
(4)各异构体可依据结构的差异进行确认，也可用HPLC-MS确认。
6、数据处理
(1)将不同流动相组成下各色谱峰的保留时间、半峰宽、峰面积整理成表，并计算分离度。
(2)总结流动相中添加极性溶剂异丙醇对溶质保留行为的影响规律。
参考资料：现代仪器分析实验与技术
