生化分析仪常用分析方法
发布时间：2017-09-01
自动生化分析仪是集电子学、光学、计算机技术和各种生物化学分析技术于一体的临床生物化学检测的主要工具。它的分析方法基于常规生物化学实验室的基本方法，如终点法、连续监测法和比浊法等，借助仪器的机械和电子装置做进一步扩展。常用的自动生化分析仪分析方法主要有：
(一)终点分析法(平衡法)
终点分析法是通过测定反应开始至反应达到平衡时的产物或底物浓度的总变化量求出待测物质浓度或活性的方法。它的反应是基于反应达到平衡时反应产物的吸收光谱特征及其对光吸收强度的大小，对物质进行定量分析的一类方法。根据时问一吸光度曲线变化，反应到达平衡时吸光度不再变化。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。
终点时间的确定：①根据时间一吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲线上3～5分钟时其吸光度已经趋向稳定，因而可将5分钟作为反应终点。②根据被测物质反应终点结合干扰物的反应情况来确定，如在溴甲酚绿法测定血清白蛋白时，白蛋白与溴甲酚绿在10秒内很快完成反应，之后α-球蛋白与β-球蛋白与溴甲酚绿发生“慢反应”，使反应曲线上吸光度在10秒后仍继续缓慢上升，持续约10分钟，因此终点时间应采用10～30秒，而不选择10分钟。
1、一点终点法指样品和试剂混合后发生反应，在时间一吸光度曲线上吸光度不再改变，选择一个时间点测定吸光度，根据吸光度计算出待测物浓度，相应反应曲线见图19-6。临床常用于总蛋白和白蛋白等项目的测定，该法简便，但易受样品、试剂颜色、血清浊度及干扰物的影响。
其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=(待测吸光度AU-试剂空白吸光度AB)×K。K为校准系数。
2、两点终点法在第二试剂加入以前，选择某一点读取吸光度值A1，它就要由样品本身或第一试剂与样品的非特异反应引起，相当于样品空白；加入第二试剂后经过一定时间反应到达终点(平衡)后选择第二个点读取吸光度A2，△A=A2-A1，据此计算待测物浓度，此称为两点终点法。需要注意的是，A1与A2测定时反应体积不同，因此需采用体积校正因子K0进行校正，K0=(Sv+R1)／(Sv+R1+R2)。目前的全自动生化分析仪除Dade dimension需用户设定K0外，其他型号的仪器均具有此自动校正功能，不必手工进行校正。两点终点法的优点是可以消除在测定波长样品自身的吸光度，如溶血、黄疸和脂血，以及一些干扰物质对测定的干扰。
(二)固定时间法
固定时间法是指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度，亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。这种方法有助于解决某些反应的非特异性问题。即样品和试剂混合后分别读取延滞期后的吸光度A1和反应一定时间的吸光度A2，A=A2一A1，然后比较标准和测定的A值，计算待测物质的浓度(图19-7)。
例如，苦味酸法测定肌酐，反应最初的30秒内，血清中快反应干扰物(如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等)能与碱性苦味酸反应；在第二个30秒碱性苦味酸主要与肌酐反应，且此段时间-吸光度曲线的线性较好；在80～120秒及其以后，碱性苦味酸可与蛋白质以及其他慢反应干扰物反应。这样选用反应的第二个30秒为测定时间，同时避免了快反应物质和慢反应物质的干扰，使肌酐浓度与吸光度呈良好的线性关系，有利于提高分析的特异性和准确度。
(三)连续监测法
连续监测法是通过连续测定反应过程中某一反应产物或底物的吸光度，根据吸光度的变化速率(△A/min)来计算待测物浓度或活性的方法，又称速率法、动态分析法或动力学法。
酶活性测定常用连续监测法，其检测原理是在酶促反应的最适条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法，在反应速度恒定期(零级反应期)连续观察和记录一定反应时间内底物的消耗量或产物生成量的变化。以单位时间酶促反应初速度计算出酶活力的大小或代谢物的浓度。连续监测法主要适用于酶活性及其代谢产物的测定，可将多点测定结果连成线，自动选择线性反应期计算酶活性或浓度。因其可观察反应的过程，相对减少了误差，大大提高了分析速度和准确性。连续监测法要求在酶促反应的零级反应期测定，此时产物生成量或底物减少量与反应时间成正比；反应速度与酶量需呈线性关系，同时考虑影响酶促反应的因素，如底物的种类和浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。其检测方法都是在反应的线性期连续观察，计算出单位时间内的吸光度。其具体方法有：
1、两点速率法在酶促反应的零级反应期，观察两个时问点的吸光度变化，用两个吸光度的差值(△A)除以时问(分钟)，得到每分钟的吸光度，计算酶活性或浓度。
2、多点速率法 即在酶促反应的零级反应期，每隔一定时间(2~30秒)监测一次，连续监测多次，求出单位时间内吸光度的变化，计算酶活性或浓度。这种方法可分为：
(1)最小二乘法：通过最小平方法求得单位时间内的吸光度变化，得到样品中待测物质的浓度或活性。该方法是全自动生化分析仪上最常用的速率法。
(2)多点δ(delta)法：求出各点吸光度差值即δ=An一Ann-1，取符合线性反应段的δ值，计算酶浓度或活性。
(3)回归法：该法是对获得的数据进行回归分析，去掉斜率值过大或过小的部分，计算酶浓度或活力。此法能有效克服因酶活力不同所致反应曲线不一样和零级反应期的时间不同带来的误差，客观地确定每一个样品的线性反应段来读取吸光度，提高了测定的准确性。
(4)速率时问法：速率时间法是由于连续观测的间隔时间太短，产物生成或底物减少的量太少，形成的信号较弱，无法进行准确监测而采用的一种方法。仪器设计中设立了速率时间(即读数的总时间)这一参数，计算机按照速率时间的信号计算结果，这样可以在不减少数据点的情况下，增大读数点的值，降低误差，提高准确度。
此外，连续监测法中还有双项同时测定连续监测法、三点双项同时测定法等，在此不一一介绍。
(四)比浊测定法
比浊法是一种通过检测物质对光的散射或透射强度来测定物质的方法。比浊法可分为化学比浊法和免疫比浊法，免疫比浊法又可分为透射比浊法和散射比浊法。自动生化分析仪一般只能做透射比浊分析。透射比浊法是在光源的光路方向测量透光强度，它常用于终点法测定。目前自动生化分析仪常用的比浊法是免疫透射比浊法，主要用于血清特种蛋白的检测，如载脂蛋白、免疫球蛋白、微量蛋白、急性时相反应蛋白以及某些药物监测等。
参考资料：分析化学
