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高效液相色谱法α-VE在反相HPLC上的定量分析
发布时间：2017-09-01
1、实验目的
(1)熟悉高效液相色谱仪的操作方法。
(2)了解反相键合相色谱的原理和应用。
(3)了解紫外检测器的原理、应用以及最佳波长选择的重要性。
2、实验原理
反相色谱与正相色谱组成相反，是以非极性或弱极性的固定液制成的固定相，以极性或相对强的极性溶剂作为流动相组成的液-液分配色谱。但目前多是采用化学反应的方法将非极性或弱极性的有机物分子键合到载体表面，制成键合相的固定相，所以也称键合相色谱。这种色谱的分离机理比较复杂，一般认为是液-固吸附和液-液分配并存。
在反相HPLC中常用的键合相有十八烷基硅烷(C18)、辛基硅烷(C8)、氰基硅烷、氨基硅烷等。常用的溶剂有甲醇、乙腈、水等。有时需要加入某种修饰剂以获得良好的分离。例如利用反相键合相色谱分离弱酸时为了抑制它的解离，须在乙腈／水或甲醇／水流动相中加入少量的乙酸。
一般反相键合相色谱适用于分离极性较弱的样品，α-VE在其多种异构体中极性是最弱的一种，在C18柱上有较强的保留，最后流出色谱柱。δ-VE极性较强，最先流出色谱柱。
α-VE在220nm和292nm处有两个明显的紫外吸收峰，本实验选择292nm作为定量分析的检测波长，以排除其他物质的干扰，确保定量准确。
3、仪器与试剂
仪器：高效液相色谱仪、紫外检测器、流动相脱气装置。
试剂：无水乙醇：分析纯；
甲醇：色谱纯；
水：重蒸去离子水；
α-VE标样溶液：准确称量α-VE标样，用无水乙醇配制，浓度约1000mg／L；混合VE溶液：准确称量混合VE样品，用无水乙醇溶解并定容至250ml容量瓶中)。
4、实验内容与步骤
(1)按照仪器操作说明开机。
(2)设置色谱仪参数：色谱柱为C㈤流动相为甲醇／水(体积比为100／0)，流速为1.0mL／min，柱温30℃，紫外检测波长为292nm，进样量20μL。
(3)检查流路确无气泡后，启动色谱系统，待基线稳定。
(4)注入v。混合样品，待样品中所有色谱峰流出后结束分析。
(5)将流动相配比变为甲醇／水为97／3(体积比)，重复(4)的操作，比较分离情况。
(6)注入α-VE标样，用保留时间确认VE混合样品中α-VE峰位。
(7)改变检测波长为254nm，重复(4)的操作，比较检测结果。
(8)调整到最佳色谱条件(包括流动相、检测波长、流速、柱温等)，待基线稳定。
(9)稀释α-VE标样，使浓度与VE混合物中α-VE的浓度相匹配(峰面积值相近)。
(10)注入稀释后的α-VE标样，重复3次(面积误差小于3％)，取平均值。
(11)注入混合VE样品，重复3次(峰面积误差小于3％)，取平均值。
(12)按仪器操作说明关机。
5、注意事项
(1)紫外检测器灵敏度较高，定性时可将a―Ve标样稀释至50～100mg／L。
(2)选择最佳色谱条件时既要注意分离度又要考虑到分析时间，尽量做到高效、高速、高灵敏度。
6、数据处理
(1)计算不同流动相组成时α-VE的分离度。
(2)用外标法计算V。混合物中α-VE的含量。
参考资料：现代仪器分析实验与技术
