分析参数设置
发布时间：2017-09-01
自动生化分析仪的参数就是仪器工作的指令，参数的正确设置和合理使用是仪器正常工作的前提条件，操作者通过设置正确的参数控制仪器完成一系列复杂而有序的操作程序。
指挥仪器工作的参数有很多，有些参数在生产制造中已设置好，如机械操作、计算机软件等，只需选择即可进行工作。自动生化分析仪操作者需进行设置的参数包括波长、温度、样品量和试剂量、测定方法、校正方法、反应时间和控制因素等。
(一)波长的选择
测定波长的选择有3个主要条件：①待测物质在该波长下的光吸收最大；②其吸收峰宜较宽而钝，而不是处于尖峰或陡肩，一般不选光谱中的末端吸收峰，换句话说，该吸收峰处的吸光度随波长变化较小；③常见干扰物在该波长下的光吸收最小。试剂盒说明一般已提供波长参数。实际波长选择需要了解待测物质和干扰组分对不同波长单色光的吸收程度，即以波长为横坐标、吸光度为纵坐标作吸收光谱曲线(光吸收曲线)。
1．单波长 单波长是用一个波长检测物质的光吸收强度的方法。当测定体系中只含有一种组分或混合溶液中待测组分的吸收峰与其他共存物质的吸收峰无重叠时，可选用该方法。如果一个物质有几个吸收峰，可选择吸光度最大的一个波长，或者选择在吸收峰处吸光度随波长变化较小的某个波长。
2．双波长或多波长 用2个或多个不同波长检测。当被检溶液混浊或存在较大干扰物质的光吸收时会出现光散射和非特异性光吸收，从而影响测定结果的准确性，此时可用2个或多个不同波长测定。双波长的应用是为了消除样品中对测定有干扰的物质的影响，而实际应用中选择辅助波长主要用于消除脂血、溶血、黄疸的干扰。脂血样品中的脂质吸收光谱在300～600nm均有吸收，呈逐渐下降的趋势；溶血样品中的血红蛋白在350nm、400nm、540nm、580nm有4个吸收峰；黄疸样品中的胆红素在300～500nm均有吸收，在400～500nm之问有强吸收峰。由于脂血、溶血、黄疸样品在较宽的波长范围内有较强的吸收光谱存在，因而常常同测定波长有重叠，此时测得的吸光度包含待测物质的吸光度和干扰物质的吸光度，选用辅助波长可消除干扰物质的吸光度。根据光吸收曲线选择最大吸收峰作为主波长，副波长的选择原则是干扰物在主波长的吸光度与副波长的吸光度越接近越好，测定时主波长的吸光度减去副波长的吸光度可消除溶血、浊度等干扰物的影响，如己糖激酶法测定血糖主波长340nm，副波长可选380nm，因为血红蛋白在这两个波长的吸光度相同，对消除溶血和浊度的影响比较有效，提高了测定结果的准确性。同时还需注意副波长不能设在有色物吸收的灵敏区域，否则会降低测定的灵敏度。
(二)温度的选择
自动生化分析仪通常设有25℃、30℃、37℃三种温度，为了使酶反应的温度与体内温度一致，一般固定为37℃。此项一般在系统参数中设置。
(三)样品量与试剂量
各种分析仪的最小反应液总体积为80～500µl不等，样品量和试剂量的设置主要由样品体积分数(sample volume fraction，SVF)来决定。SVF是样品体积(Vs)与反应总体积(Vt)的比值，即SVF=Vs/Vt。Vt包括了反应体系中所用的样品体积、样品稀释液体积、试剂(单、双试剂或多试剂)体积、试剂稀释液体积之和。
样品量与试剂量一般可按照试剂说明书上的比例，并结合仪器的特性，如样品和试剂最小加样量及加样量范围、最小反应体积等进行设置。SVF越大，线性范围越窄，但灵敏度越高；随意改变SVF不尽可靠，尤其是测定酶活性时，将酶样品稀释，SVF减少，酶的变性失活、酶的抑制或激活、酶的聚合或解离等随之发生改变，酶活性并不与SVF成正比。如果根据手工法按比例缩减或重新设计，仍需考虑仪器的检测灵敏度、线性范围及样品中其他成分的影响。
(四)试剂的选择
I．单试剂法反应体系中只加一种试剂的方法称为单试剂法。常见的有：①单试剂单波长法：指在选定的温度和特定波长的情况下，读取反应一定时间时的吸光度，在单试剂法中最常见。反应时间应该根据反应特性和特定仪器而定，以不超过仪器的一个分析周期为佳；反应温度常选择37℃。②单试剂双波长法：该法的主要目的是为了消除检测体系或样品的混浊，常用于终点分析。③样品空白法：该法使用单波长或双波长均可，当使用双波长法仍不能纠正混浊、色素、脂血等影响时，常用本法。
2．双试剂法在反应过程中试剂分开配制和加入反应系统，可以消除一些干扰和非特异性反应，确保检测结果的准确性。常见的有：①双试剂单波长一点法：检测试剂分成两部分加入，只读一次吸光度，不宜采用单试剂时可用此法。②双试剂两点法：在加入第一试剂后读取吸光度(此时试剂与标本不发生反应，吸光度为标本或试剂所产生)，再加第二试剂，反应一定时间后再读取吸光度，以两次吸光度之差计算结果。此法不但可以避免试剂不稳定造成的影响，还可以消除标本带来的某些影响，使检测结果更准确。目前较多的全自动生化分析仪的终点分析均可用此法。③双试剂双波长法：目前有的仪器用双波长，有的可自行设置。因为不同的仪器具有不同的功能，实际工作中应根据需要而定。
(五)测定方法的选择
本节中已介绍了几种常用的分析方法，半自动生化分析仪一般具备其中的一点终点、两点终点(单试剂)、连续监测法(只能是一种固定方法)。全自动生化分析仪的功能比较全面，具备前述的各种方法，可以根据仪器的分析项目及需要设置，选择相应的分析方法。
(六)分析时间的选择
分析时间的选择和设定是自动生化分析仪参数设定的重要环节，直接影响检测结果的准确性。生化反应的时间是某一项目所特有的，根据所采用的测定方法不同而异。对于终点分析，测定时间的选择应充分考虑到干扰的问题。一点终点法的分析时间应设在待测物质反应将完成时，过早会由于反应未达到终点而影响结果的准确性，过迟易受其他反应物质干扰。例如，应用一点终点分析法的溴甲酚绿法测定白蛋白时，白蛋白Iq溴甲酚绿反应快，在1分钟内基本上反应完全，随着反应时间的延长，α-球蛋白同溴甲酚绿反应形成干扰，因而溴甲酚绿法测定白蛋白，其测定时间应定于1分钟。两点终点法应选择合适的第一试剂和第二试剂加入时间，以消除标本空白和内源性物质干扰。连续监测法一般用于酶活力的测定，而酶活力的大小是用反应速度来表示，因而要求在零级反应期内测定反应速率，此时的反应速率不受底物浓度的影响，仅同酶活力大小有关。对于一种物质的测定，由于选择试剂和分析方法不同，其测定时问也随之变化，因而对于特定的试剂和分析方法，应先仔细观察时问．反应进程曲线，从曲线上选择最佳的测定时间。
(七)线性范围的选择
当反应吸光度处于线性范围内时，检测结果与吸光度变化成正比，准确反映待测物的浓度。如果吸光度设置过小，则非线性机会出现会增多，或观察时间延长，工作效率降低；如吸光度设置过大，则失去了判断线性的意义。线性范围应选择数据收集窗时间内吸光度变化的允许范围，对于全自动生化分析仪而言，主要是设定吸光度的最大值和最小值。
(八)校正方法
自动生化分析仪内设置的校正方法一般包括一点校正、二点校正、多点校正、线性校正、非线性(对数、指数法、量程法)校正等。一点法校正曲线为通过坐标零点和校准点的一条直线，常用于酶类项目测定，例如ALT、AST、LDH等；二点校正法是指用一个浓度的标准品和一个空白试剂进行校正的方法，二点法校正曲线是通过设定的两个校准点，但不通过坐标零点的一条直线，该法要求反应必须符合Lamber-Beer。定律，例如TP、ALB、TG等，可用于终点法及连续监测法的校正；多点校正法是多个具有浓度梯度的标准品用非线性法进行校正，多点法的校正曲线不是一条直线，而可能是对数曲线、双曲线或不规则曲线，多用于免疫浊度法等工作曲线呈各种曲线形式的校正，例如CRP、ApoA I、Lp(a)等。线性曲线的浓度与吸光度呈线性。非线性校正包括各种对数和指数校正及量程法校正。量程法是根据标准曲线上每两点问浓度与吸光度的关系计算待测物的浓度。非线性曲线包括对数曲线、指数曲线、二次方程曲线、三次方程曲线、Logit转换和．logistic函数。标准曲线呈对数或指数曲线特征的项目选择所对应的方法校正；二次方程曲线呈抛物线，校准点需大于4点；三次方程曲线呈双抛物线或多峰形，医学实验室中的曲线常有一凸一凹的拐点，类似S形，校准点需大于5，是免疫比浊法常用曲线；Logit转换和logistic函数校准点数目应比参数的数目多2。
参考资料：分析化学
